"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF6847
ETF6847 (ETF6847) "Rekombinantsete valkude in-vivo isotoopmärgistamise on-line optimeerimine. (1.01.2006−31.12.2009)", Kalju Vanatalu, Tallinna Tehnikaülikool, Matemaatika-loodusteaduskond.
ETF6847
Rekombinantsete valkude in-vivo isotoopmärgistamise on-line optimeerimine.
On-line optimisation of in-vivo isotopic labelling of recombinant proteins.
1.01.2006
31.12.2009
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
4. Loodusteadused ja tehnika4.16. Biotehnoloogia (loodusteadused ja tehnika) 2.3. Teised tehnika- ja inseneriteadused (keemiatehnika, lennundustehnika, mehaanika, metallurgia, materjaliteadus ning teised seotud erialad: puidutehnoloogia, geodeesia, tööstuskeemia, toiduainete tehnoloogia, süsteemianalüüs, metallurgia, mäendus, tekstiilitehnoloogia ja teised seotud teadused).100,0
PerioodSumma
01.01.2006−31.12.2006122 400,00 EEK (7 822,79 EUR)
01.01.2007−31.12.2007122 400,00 EEK (7 822,79 EUR)
01.01.2008−31.12.2008122 400,00 EEK (7 822,79 EUR)
01.01.2009−31.12.2009117 504,00 EEK (7 509,87 EUR)
30 978,24 EUR

Nii teaduses kui biomeditsiinis on järjest suurenenud vajadus toota suurel hulgal erinevaid rekombinantseid ning ka isotoop-märgistatud valke ja peptiide. Meie uurimisgrupp on välja töötanud mitmed fermentatsioonimeetodid, mille abil on õnnestunud toota ja ka puhastada terve rida rekombinantseid (sh märgistatud) valke. Sellele vaatamata on kogu tootmisprotsess keeruline ja selle erinevate etappide saagiste varieeruvus on ebaselgetel põhjustel väga suur. On teada, et ebasoodsates tingimustes käivituvad (bakteri)rakkudes stressimehhanismid, samuti vallandab stressi ka defektse või võõrvalgu süntees ning ilmselt ka järsud muutused kasvukeskkonnas, mis kõik omakorda võivad vähendada rekombinantse valgu produktsiooni. Valgu ekspressiooni optimeerimine nõuab seega lisaks stressi mehhanismide üle kontrolli saavutamisele ka paljude kasvuparameetrite optimeerimist. Seetõttu on käesoleva töö eesmärgiks uurida(ning hiljem ka juhtida) rakukultuuri seisundit kultiveerimise/ekspressiooni etapis kasutades stressi-reportersüsteemidega baktereid ning samuti kasutades teist reportervalku selleks, et jälgida rekombinantse valgu sünteesi. Sobivate stressivalkude valikuks kavatseme uurida nende avaldumist erinevates kasvutingimustes 2D-elektroforeesi abil. Praegu olemasolev fermentatsioon-arvuti süsteem võimaldab automaatselt optimeerida rakkude kasvu- maksimeerida kasvukiirust ja leida substraatide lisamise suhted. Kavatseme seda süsteemi täiendada on-line fluorestsentsi mõõtmise seadmetega, et jälgida pidevas rezhiimis raku sees toimuvaid protsesse- meid huvitava valgu sünteesi ning stressi taset. Selline süsteem võimaldaks autonoomselt läbi viia katseseeriaid vastavalt etteantud rezhiimile ning rakendada juhtimisalgoritme rekombinantse valgu tootmisprotsessi automaatseks optimeerimiseks. Väljatöötatud lähenemine võimaldab täpsemalt mõista rekombinantse valgu tootmisel rakus toimuvaid protsesse ning tänu pidevas rezhiimis mõõtmistele kogu protsessi efektiivsust hüppelisekt tõsta tänu paremale saagisele, kokkuhoiule ajas ja materjalide kulus ning riskide vähendamisele. Objektidena kavatseme kasutada esmajoones hedgehog-signaalraja valke: SKI, Gli-valgud, Dyrk, SUFU jt.
There is an increasing demand for the production of recombinant and isotopically labelled proteins and peptides both in science and biomedicine. Our group has developed several new fermentation methods which have been used also for the production and purification of many recombinant and isotopically labelled proteins. In spite of this we have to admit that the whole production process is complicated and the yields in different steps vary greatly for obscure reasons. It is known that stress mechanisms take place in (bacterial) cells when the conditions become unfavourable (eg heat shock and cold shock), stress is evoked by the synthesis of defective or of a foreign protein. Apparently also the rapid changes in the cultivation conditions can evoke the stress mechanisms in the cell which in turn can reduce the level of production of the heterologous protein. Thus, in addition to the control over stress mechanisms also the cultivation parameters have to be tuned out to achieve when optimising the protein expression. Therefore the aim of this project is to study(and later also to control) the state of the cells during the stage of cultivation/expreession. For this we intend to apply bacteria with stress-reporters and also to use (the other) fluorescent reporter for the measurement of the level of synthesis of the recombinant target protein. In order to choose the appropriate stress-protein it is planned to study the expression of different stress-proteins at variable cultivation conditions with the use of 2D-electrophoresis. The existing fermenter-computer system is capable to automatically optimise the growth of cells- to maximise the growth rate or find the best optimal ratio of different growth substrates added simultaneously. As we already have constructed the device for measuring optical density on-line we can use this experience also for the construction of on-line fluorimeters. This will enable us to follow on-line the processes occuring in the cell- the level of stress and the synthesis of the recombinant target protein. Such a system would make it possible to carry out series of optimisation experiments automatically by the computer according to the pregiven variation of cultivation parameters and also to apply control-algorithms for the automatic optimisation of the process of recombinant protein production. This approach will make it possible to better understand the intracellular processes during the production of recombinant proteins due to the on-line measurements and significantly increase theefficiency of the whole process due to the better yield, saving time and material expenditures and reducing risks. As objects of study we plan to use mainly the proteins of the hedgehog-signalling pathway: SKI, Gli-proteins, Dyrk, SUFU.