See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9318
ETF9318 "Alheimeri amüloid-beeta fibrillide moodustumine, toksilisus ja võrdlus teiste amüloidsete peptiididega (1.01.2012−31.12.2015)", Vello Tõugu, Tallinna Tehnikaülikool, Matemaatika-loodusteaduskond.
ETF9318
Alheimeri amüloid-beeta fibrillide moodustumine, toksilisus ja võrdlus teiste amüloidsete peptiididega
Alzheimer’s beta-amyloid fibrillar aggregates, mechanism of formation, toxicity and comparison with other amyloidogenic peptides in vitro.
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201212 000,00 EUR
01.01.2013−31.12.201312 000,00 EUR
01.01.2014−31.12.201412 000,00 EUR
01.01.2015−31.12.201512 000,00 EUR
48 000,00 EUR

Amüloidsete valguagregaatide tekkega organismis on seotud enam kui 60 tõbe, mille käigus moodustab organismis normaalselt lahustunud olekus esinev polüpeptiid lahustumatuid fibrillaarseid beeta-lehe struktuure. Alzheimeri tõve (AD) korral moodustuvad ajus amüloid-beeta peptiidist (AB) amüloidsed naastud, mis arvatakse käivitavat neurodenegatsioonini viivat molekulaarsete ja rakuliste sündmuste ahelat. Sünteetiline AB on tehistingimustes võimeline spontaanselt agregeeruma fibrillideks mis on eristamatud AD haigete ajus esinevatest fibrillidest. Seetõttu pakub protsessi in vitro uurimine olulist teavet fibrillogeneesi mõistmiseks. AB agregatsioon ajus toimub suure hulga erinevate molekulide ja nende komplekside juuresolekul, mis võivad protsessi kulgu oluliselt mõjutada. Mõned neist (glükoproiinid, lipiidid, membraanide fragmendid, metallioonid) võivad toimida fibrillatsiooni initsiaatoritena samas kui teised (porfüriini derivaadid, flavonoidid, vitamiinid) võivad fibrillide teket pidurdada. Fibrillatsiooni kineetika on keerukas, protsessi ajasõltuvus on sigmoidne ja sisaldab laagfaasi. Pole teada millised molekulaarsed muutused (difusioon, konformatsioonimuutus, vesiniksidemete moodustumine) limiteerivad protsessi kiirust või millised jõud protsessi käivitavad. Fibrillatsiooni kineetika kirjeldamiseks on kasutatud erinevaid formaalseid mudeleid kuid AB42 agregatsiooni ei kirjelda piisava täpsusega neist ükski. Uuringu peamiseks eesmärgiks on välja selgitada ühised ja spetsiifilised füsiko-keemilised faktorid, mis määravad ära amüloidsete peptiidide fibrillatsiooni kineetika. Võrdlevaks uurimiseks on AB kõrvale valitud rida amüloidseid peptiide mis on natiivses olekus on samuti struktuuritud: kaltsitoniin, alfa-sünukleiin, mediini polüpeptiid, insuliin ja amüliin. Kasutades enda poolt varem täiustatud fluorimeetrilist meetodit peptiidide agregatsiooni kiireks läbiviimiseks ja jälgimiseks uurime keskkonnafaktorite (pH, soolad, denatureerivad agendid) ning võimalike looduslike (lipiidid, polüsahhariidid) ja tehislike (fibrilatsiooni inhibiitorid ja ravimikandidaadid) ainete mõju välja valitud peptiidide fibrilatsioonile. Selline võrdlev uurimine aitab mõista fibrillide moodustumise mehhanismi üldiselt ja aitab kaasa mehhanismipõhiste inhibiitorite otsingule. Uuritakse ka erinevate peptiide fibrillide agregaatide võimet vallandada teiste peptiide agregatsiooni, mis võib kaasa aidata AD korral primaarset amüloidi teket vallandavate tegurite mõistmisele.
Several peptides and proteins have a common tendency to assemble into highly ordered fibrillar aggregates. The process of the fibrillization and aggregation has received much attention because the amyloid aggregates are involved in neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease (AD) and Parkinson’s disease. In Alzheimer’s disease (AD) the amyloid plaques in the brain are formed from amyloid-? (AB) peptide. AB aggregation is assumed to trigger a cascade of molecular and cellular events that leads to neurodegeneration. Synthetic AB peptides assemble spontaneously into fibrils indistinguishable from those found in the brains of AD patients, suggesting that in vitro aggregation studies are a useful tool for understanding the amyloid formation in the brain. AB aggregation in vivo occurs in the presence of a large variety of biomolecules and molecular complexes that may play an essential role in amyloidogenesis. Some of them (glycoproteins, lipids, membrane fragments, metal ions) might serve as fibril seeding agents; others, however, (porphyrin derivatives, flavonoids etc.) might inhibit fibril formation. The fibrillation is a complex process showing lag phase and sigmoid kinetics. It is not known what process is rate-limiting in fibril growth (diffusion, peptide conformational change, hydrogen bonding etc.) and what are the driving forces of the process. Several models have been proposed for the description of fibril formation; however, good description of the AB42 fibrillation kinetics has not been achieved. The main objective of the study is to find out common and specific physico-chemical factors, affecting fibrillation of AB 42 and different other amyloidogenic peptides. Several natively unfolded amyloid peptides calcitonin, alpha-synuclein and medin polypeptide, insulin and amylin are selected for the comparative study. By using our improved fluorimetric method for monitoring peptide fibrillation we study the effects of different environmental factors (pH, temp., salts, denaturating agents) and various combinations of putative endogenous (lipids, polysaccharides) and exogenous (fibrillation inhibitors and drug candidates) agents on the kinetics of the fibrillation of the selected peptides. Comparative studies of the fibrillation of various amyloidogenic peptides will help to understand the fibril formation mechanisms in general and find its mechanism-based suppressors.
AB peptiidi agregatsiooni amüloidsetesse naastudesse peetakse Alzheimeri tõve (AD) vallandavaks põhjuseks, kuid AD käivitumise mehhanism ja AB täpne roll selles on jäänud abamatuks. Paljud peptiidid ja valgud võivad moodustada fibrillaarseid agregaate in vitro, kuid ainult üksikud neist moodustavat patoloogilisi struktuure organismides. Me näitasime, et AB fibrillide kasvu kiiruse määravad ümberkorraldused monomeeri struktuuris ja AB H13 ja H14 protoneerumine pärsib fibrillisatsiooni. Lag-periood AB42 fibrillisatsioonil oli vaid kaks korda lühem ja fibrilli kasv kaks korda kiirem kui AB40. Intensiivne segamine kiirendab amüloidsete peptiidide fibrilliseerumist in vitro. Erandina ei kiirendanud segamine Ab42 fibrillisatsiooni fibrilli kasvufaasis, mis võivad põhjustada selle kõrgem amüloidogeensus in vivo. AB agregaadid võivad suurendada oksüdatiivset stressi tekitades vabu radikaale seotud Cu(II/I) ja M35 jäägi vahendusel. Me näitasime, et M35 jääk ei ole osa AB-Cu(II) kompleksi radikaalide tekitamise mehhanismist ja M35 oksüdatsioonil on vaid väike mõju fibrillisatsioonile, mis võimaldab järeldada, et võimalik metioniini oksüdatsiooni varieerumine in vivo ei tohiks mõjutada naastude teket ja toksilisust. Tsink ioonid osalevad insuliini korrektsel pakkimisel ja hoiustamise. Monomeerse Zn-insuliini kompleksi KD väärtuseks määrati 400 nM, Zn(II) sidumise afiinsus väheneb insuliini kontsentratsiooni suurenedes. Cu(II) seondub samuti insuliinile (KD = 25 nM). Tegime kindlaks, et insuliini fibrilliseerumine happelistel ja füsioloogilisel pHl toimub erinevate mehhanismide kaudu. Kasvufaktoreid volditakse oksüdatiivselt kokku endoplasmaatilises retiikulumis. IGF-1 esineb erinevates oksüdeeritud vormides, tema oksüdatsiooni poollaine potentsiaal on -332 mV ja redutseeritud vorm võib seostuda kooperatiivselt neli Cu(I), kuid ta ei konkureeri Cu(I) -siduvate valkudega. AB erinevate vormide toksilisuse määramiseks töötati välja diferentseeritud SH-SY5Y rakuliinil põhinev testsüsteem, mis võimaldab uurida ka toksilisuse mehhanisme ja potentsiaalseid inhibiitoreid.