"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF8705
ETF8705 "Bioaktiivsete makromolekulide peptiidipõhiste transportsüsteemide toimeprintsiibid ja rakendamine (1.01.2011−31.12.2014)", Margus Pooga, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF8705
Bioaktiivsete makromolekulide peptiidipõhiste transportsüsteemide toimeprintsiibid ja rakendamine
The principles and applications of peptide-based cellular delivery systems for bioactive macromolecules.
1.01.2011
31.12.2014
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.12. Bio- ja keskkonnateadustega seotud uuringud, näiteks biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika, majandus- ja tehnoloogiauuringudB210 Histoloogia, tsütokeemia, histokeemia, koekultuurid1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt34,0
4. Loodusteadused ja tehnika4.16. Biotehnoloogia (loodusteadused ja tehnika)T490 Biotehnoloogia 2.3. Teised tehnika- ja inseneriteadused (keemiatehnika, lennundustehnika, mehaanika, metallurgia, materjaliteadus ning teised seotud erialad: puidutehnoloogia, geodeesia, tööstuskeemia, toiduainete tehnoloogia, süsteemianalüüs, metallurgia, mäendus, tekstiilitehnoloogia ja teised seotud teadused).33,0
3. Terviseuuringud3.11. Terviseuuringutega seotud uuringud, näiteks biokeemia, geneetika, mikrobioloogia, biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika ja bioinformaatikaB210 Histoloogia, tsütokeemia, histokeemia, koekultuurid3.1. Biomeditsiin (anatoomia, tsütoloogia, füsioloogia, geneetika, farmaatsia, farmakoloogia, kliiniline keemia, kliiniline mikrobioloogia, patoloogia)33,0
PerioodSumma
01.01.2011−31.12.201112 000,00 EUR
01.01.2012−31.12.201212 000,00 EUR
01.01.2013−31.12.201312 000,00 EUR
01.01.2014−31.12.201412 000,00 EUR
48 000,00 EUR

Geeniekspressiooni reguleerimine lühikeste oligonukleotiididega, kasutades märklaudgeenide vaigistamist RNA interferentsi või antisensi põhimõttel, splaissingu muutmist või ekspressiooni võimendamist, on viimastel aastatel leidnud laialdast kasutamist biomeditsiinis ning võib lähiajal oluliselt muuta ka praktilist meditsiini. Paraku on oligonukleotiidid suhteliselt kergesti lagundatavad ja süsteemseks manustamiseks peab neid stabiliseerima, et nad soovitud koeni jõuaks ja seal märklaudrakkudesse siseneks. Lisaks peavad oligonukleotiidid pärast rakkudesse sisenemist säilitama terviklikkuse ja aktiivsuse endosoomides, neist välja pääsema ja lõpuks oma märklaudmolekuliga seostuma. Perspektiivikamateks oligonukleotiidide transporteriteks, mis neile tingimustele vastavad, võib pidada rakku sisenevaid/penetreeruvaid peptiide (RPP). RPPd on võimelised rakkudesse sisestama erineva suuruse ja omadustega bioaktiivseid molekule, muutes ka rakusisesed protsessid soovitud suunas mõjutatavaks. Lisaks on võimalik RPP-sid kombineerida peptiididega, mis jaotuvad organismis selektiivselt kas märklaudorganisse või haiguskoldesse/tuumorisse, võimaldades seega ka suunatud transporti kas siis organismi või ka raku tasemel. Mitmed in vitro ja in vivo uuringud on näidanud, et sel viisil rakkudesse sisestatud toimeained on seal aktiivsed, samas kui transportpeptiidid ise kahjulikke kõrvalmõjusid ei oma. Käesolevas projektis jätkame me RPP-de ja nendega vahendatud rakku transpordi mehhanismide uurimist, uute täiustatud RPP-de disainimist ja kirjeldamist ning nende selektiivsuse ja rakendatavuse uuringuid. Taotletava projekti põhiülesanneteks on: 1. Efektiivselt membraani läbivate RPP-de valik ja nende rakupinnal asuvate „retseptorite“ kirjeldamine plasmamembraanist valmistatud vesiikulites, mis käituvad kui raku lihtsustatud mudel 2. RPP nanopartiklite iseloomustamine ning nende tekke ja rakku sisenemise seoste analüüs 3. RPP ja oligonukleotiidi komplekside partiklite kirjeldamine ja rakkudesse sisenemise ning seal liikumise molekulaarsete mehhanismide analüüs 4. RPP-de ja nende lastmolekulide endosoomidest väljumise mehhanismide analüüs ja indutseerimine 5. Uute RPPde loomine ja transportomaduste kirjeldamine 6. Uute RPPde ja nendega vahendatud transpordi mõju analüüs in vitro tingimustes 7. Suunavate peptiidide selektiivsuse ja efektiivsuse analüüs ex vivo süsteemis 8. Regulatoorsete oligonukleotiididega implantatsiooni mõjutamise võimaluste analüüs in vitro mudelis.
The regulation of gene expression by short oligonucleotides using the RNA interference, antisense, splicing redirection or activation principles has found wide application in biomedical research in recent years; and it could markedly change the medicine in the near future. However, for the systemic administration, the oligonucleotides, which are sensitive to degradation per se, must survive in circulation long enough to reach the target tissue and enter the desired cells. In addition, in cells the up taken oligonucleotides must outlast the hostile interior of endosomes, escape from there and finally associate with the targeted complementary sequence either in cytoplasm or nucleus. One of the most promising vehicles to fulfil these requirements could be considered cell-penetrating peptides (CPP), which induce the cellular uptake of bioactive molecules of different size and nature, making the intracellular regulatory pathways targetable. In addition, fusion of a CPP with addressing sequences results in vectors with remarkable selectivity enabling tumour- or tissue specific transport and conferring these peptides additional advantage over other delivery systems. The numerous in vitro and in vivo studies that demonstrate the high biological activity of the cargo inserted into cells by CPPs whereas the vector peptide does not exert toxic effects, corroborate the high potential of CPPs as carriers for therapeutics. We continue addressing the questions of the internalization and transduction mechanism(s) of CPPs, design and characterisation of the selectivity of novel CPPs applicable as delivery vectors. The goals of the project are: I. Selection of efficiently membrane translocating CPPs and cell surface receptors of CPPs using giant plasma membrane vesicles as a model mini cell. II. Characterization of CPP nanoparticles and their (role in) cell translocation. III. Elucidation of the cell entry mechanisms of CPP-oligonucleotide complexes. IV. Mapping of the endosomal escape of CPPs and their complexes with bioactive cargo, and induction of liberation. V. Characterization of new CPPs. VI. Characterization of adverse effects of novel CPPs and CPP-cargo constructs. VII. Characterization of addressing peptide sequences in endometriosis specimens in ex vivo assay. VIII. Modulation of implantation with regulatory oligonucleotides complexed with CPPs using in vitro assays
ETF8705 projekti raames me analüüsisime rakku penetreeruvate peptiidide (RPP, CPP) mehhanisme rakkudesse sisenemisel ning rakendasime neid erinevate bioloogiliselt aktiivsete molekulide sisestamiseks elusrakkudesse. Uurimistöö tulemustest avaldasime eelretsenseeritavates ajakirjades 17 artiklit ning 3 peatükki raamatutes/mongraafiates. Lisaks on 2 peatükki on avaldamisel ja 2 artikli käsikirja ootamas ajakirjade otsust. Projekti raames kaitsti 2 doktori- (H. Räägel ja A. Lorents), 4 magistri- (H. Margus, J. Pae, C. Juks ja M. Hein) ning mitmed bakalaureusetööd. Olulisimate projekti tulemuste osas võiks välja tuua: 1) Rakkude plasmamembraanist valmistatud vesiikulid (PMV) on väga hea mudel RPP-de mehhanismide analüüsiks. PMV-de abil tõestasime, et RPP-d suudavad tõepoolest bioloogilisi membraane läbida ka ilma endotsütoosi indutseerimata. 2) RPP-sid saab jagada kahte rühma selle järgi, kuidas nad mõjutavad Ca rakusisest kontsentratsiooni, ning millised molekulid on vajalikud peptiidi penetreerumiseks läbi plasmamembraani (kas valgud või glükaanid) 3) RPP-de penetreerumine sõltub membraanide keemilisest koostisest: kolesterooli eemaldamine hõlbustab membraanide läbimist ja selle lisamine takistab. Valkude lagundamine plasmamembraani välisküljel blokeerib polükatioonsete RPP-de membraanide läbimise, aga ei mõjuta amfipaatseid peptiide. 4) RPP-dega vahendatud valkude transpordil rakkudesse säilitavad viimased oma terviklikkuse ja aktiivsuse. Rakkudesse sisestatud valke saab vabastada endosoomidest fotodünaamilist efekti kasutades. 5) Teise põlvkonna RPP-d moodustavad nukleiinhapetega regulaarseid osakesi, mida võib käsitleda nanopartiklitena. Sellised partiklid seonduvad plasmamembraanil SCARA tüüpi retseptoritega ja indutseerivad efektiivselt endotsütootilisi protsesse. 6) PF ja NF on väga efektiivsed vektorid erinevate omaduste ja aktiivsustega nukleiinhapete sisestamiseks rakkudesse. Keemiliselt väga sarnased peptiidid võivad kasutada erinevaid mehhanisme lastmolekulide toimetamiseks rakkudesse. 7) CPP-d transpordivad miRNA raskesti transfekteeritavatesse rakkudesse.