"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF8449
ETF8449 "Mitokondriaalsete (ja tuuma) helikaaside IRC3 ja IRC20 funktsionaalne analüüs (1.01.2010−31.12.2013)", Tiina Sedman, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF8449
Mitokondriaalsete (ja tuuma) helikaaside IRC3 ja IRC20 funktsionaalne analüüs
Functional characterization of the mitochondrial (and nuclear) helicases IRC3 and IRC20
1.01.2010
31.12.2013
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ValdkondAlamvaldkondCERCS erialaFrascati Manual’i erialaProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.12. Bio- ja keskkonnateadustega seotud uuringud, näiteks biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika, majandus- ja tehnoloogiauuringudP320 Nukleiinhappesüntees, proteiinisüntees 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2010−31.12.2010192 000,00 EEK (12 271,04 EUR)
01.01.2011−31.12.201112 271,20 EUR
01.01.2012−31.12.201212 271,20 EUR
01.01.2013−31.12.201312 271,20 EUR
49 084,64 EUR

Genoomse DNA stabiilsus on hädavajalik normaalseks rakkude kasvuks ja eluks. Eukarüootne rakk kasutab mitmeid alternatiivseid DNA vigade parandamise mehhanisme, kaasaarvatud homoloogiline recombinatsioon (HR). Mudelorganismis S. cerevisiae toimub vastuseks DNA kahjustustele, mis blokeerivad replikatsioonikahvli, HR-s osalevate valkude kogunemine tuuma, kus nad moodustavad kompleksi Rad52 valguga. On teada, et mutatsioonid paljudes tuntud replikatsiooni, reparatsiooni ja transkriptsiooni valkudes põhjustavad Rad52 HR-i komplekside arvu suurenemist. Hiljuti kirjeldati rida uusi tundmatu funksiooniga valke mille deleteerimine põhjustas Rad52 komplekside hulga suurenemise. Need 22 valku nimetati IRC valkudeks (Increased Recombination Centers). IRC3 ja IRC20 on in silico analüüsi põhjal mitokondriaalsed helikaasid. Respiratsioon toodab ATP-d , kuid kõrvalproduktina ka reaktiivseid hapniku molekule, mis omakorda kahjustavad mtDNA-d ja ka teisi rakulisi komponente. Käesoleva projekti käigus soovime iseloomustada evolutsiooniliselt konserveerunud S.cerevisiae valke Irc3 ja Irc20 ja saada aru nende rollist Rad52 komplekside formeerimisel. On võimalik, et nende valkude IRC fenotüüpi saab seletada nende funktsiooniga mitokondris; alternatiivsel juhul, kui seni kirjeldamata isovormid lokaliseeruvad tuuma, võivad nad otseselt osaleda HR-s. Meie plaanime põhjalikumalt analüüsida nende valkude lokalisatsiooni rakkudes. Samuti plaanime teha pärmitüved, milles IRC3 ja IRC20 geenid on deleteeritud või sisaldavad irc3 ja irc20 mutante, millel puudub mitokondriaalne lokalisatsiooni signaal. Nende tüvede abil saame analüüsida Irc3 ja Irc20 valkude rolli eraldi tuumas ja mitokondris. Plaanime uurida nende kahe valgu osalust ROS-ide (reactive oxygen species) tekkes, mitokondriaalses geeni ekspressioonis, mtDNA replikatsioonis või reparatsioonis. Lisaks puhastame rekombinantsed Irc3 ja Irc20 valgud ja teostame nende valkude biokeemilise analüüsi.
Maintaining genome stability is crucial for cell survival and normal cell growth. Eukaryotic cells use several alternative repair mechanisms including homologous recombination (HR), base excision and mismatch repair to keep the rate of genome alternations and mutations at very low level. In model organism S. cerevisiae, one of the responses to DNA damage is the localization of HR proteins into discrete subnuclear Rad52 foci. Mutations in many known genes involved in DNA metabolism including replication and repair, transcription, and chromatin remodeling have been shown to increase the Rad52 foci formation. Recently a set of 22 novel IRC (Increased Recombination Centres) genes was defined. Two Irc proteins, putative helicases IRC3 and IRC20 with unknown functions, are probably localized into mitochondria. Respiration in mitochondria produces cellular ATP but also reactive oxygen species (ROS) which can damage nuclear and mitochondrial DNA. We would like clarify the functions Irc3 and Irc20 proteins and understand their role in Rad52 foci formation. It is possible that their mitochondrial functions explain the IRC phenotype; alternatively their undetected nuclear isoforms have a direct role in HR. We will carefully analyze the localization of Irc3 and Irc20 proteins in yeast cells, generate yeast strains that lack the proteins altogether, or contain Irc3 and Irc20 mutants that are not targeted to mitochondria. We will analyze the irc3 and irc20 nuclear and mitochondrial phenotypes, the roles of Irc3 and Irc20 in reactive oxygen species generation, mitochondrial gene expression, mitochondrial DNA replication and mitochondrial DNA repair and mutagenesis. Biochemical characterization of purified Irc3 and Icr20 proteins will be performed.