"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF7407
ETF7407 "Alfaviiruste replikatsioon, interaktsioonid peremeestega ja nende protsesside inhibiitorid (1.01.2008−31.12.2011)", Andres Merits, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Tehnoloogiainstituut, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Tehnoloogiainstituut, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond.
ETF7407
Alfaviiruste replikatsioon, interaktsioonid peremeestega ja nende protsesside inhibiitorid
Alphavirus replication, inhibition and virus-host interactions.
1.01.2008
31.12.2011
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.2. MikrobioloogiaB230 Mikrobioloogia, bakterioloogia, viroloogia, mükoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt34,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP320 Nukleiinhappesüntees, proteiinisüntees 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt33,0
4. Loodusteadused ja tehnika4.16. Biotehnoloogia (loodusteadused ja tehnika)T490 Biotehnoloogia 2.3. Teised tehnika- ja inseneriteadused (keemiatehnika, lennundustehnika, mehaanika, metallurgia, materjaliteadus ning teised seotud erialad: puidutehnoloogia, geodeesia, tööstuskeemia, toiduainete tehnoloogia, süsteemianalüüs, metallurgia, mäendus, tekstiilitehnoloogia ja teised seotud teadused).33,0
PerioodSumma
01.01.2008−31.12.2008280 800,00 EEK (17 946,39 EUR)
01.01.2009−31.12.2009269 568,00 EEK (17 228,54 EUR)
01.01.2010−31.12.2010245 034,00 EEK (15 660,53 EUR)
01.01.2011−31.12.201115 660,00 EUR
66 495,46 EUR

Chikungunya viiruse põhjustatud epideemia India ookeani ümbritsevatel aladel näitab, et moskiitodega levivad alfaviirused kujutavad endast olulisi ja ohtlike patogeene. Peale selle on tähtsad ka alfaviirustel põhinevad vektorid, mida kasutatakse nii bio-kui ka geenitehnoloogias. Projekti käigus on kavas konstrueerida uusi molekulaarseid tööriistu ja süsteeme, mida saab kasutada nii viiruste inhibiitorite kui ka alfaviiruste molekulaarbioloogia ja viirus-peremees interaktsioonide uurimiseks. Alfaviiruse RNA replikatsioon rakkudes toimub membraansetel struktuuridel; selline replikatsioonimehhanism iseloomustab ka teisi positiivseid RNA viiruseid. Kavandatud uuringu üheks eesmärgiks on välja selgitada, millised on nende membraansete struktuuride moodustamise mehhanismid ja millised komponendid selles osalevad. Selline analüüs võimaldab leida uusi sihtmärke viiruste-vastaste ühendite jaoks; eriti oluline on seejuures asjaolu, et sellised sihtmärgid võivad olla universaalsed paljudele viirustele ka väljaspool alfaviiruste perekonda. Alfaviiruste RNA replikatsiooni reguleerimise võtmevalguks on mittestruktuurne valk nsP2, mis teostab replikaasi polüproteiini lõikamist valmis valkudeks. Selle valgu funktsioonide uurimisel saadud tulemused on meil võimaldanud konstrueerida uudsed geeniekspressioonivektorid, milles markervalgud on paigutatud nsP2 proteaasi äratundmise saitide vahele või viiruse struktuursesse alasse. Sellised viirused on elujõulised ja sarnanevad fenotüübilt metsikut tüüpi viirusega. Lutsiferaas-tüüpi markerite kasutamine sellistes vektorites võimaldab luua viirus-vastaste ühendite analüüsimiseks vajalikke süsteeme; fluorestseeruvate markerite kasutamine võimaldab luua viiruseid, mille levikut kudedes on võimalik efektiivselt jälgida. Peroksidaasi kodeeriv marker võimaldab läbi viia kõrge tundlikusega elektron-mikroskoopilisi uuringuid; afiinsus-tage sisaldavate markerite kloneerimine võimaldab viiruse-valkudega seonduvate raku komponentide uurimist. Oluline on antud uurimuse kavas ka see, et neid lähenemisi kavandatakse kasutada paraleeleselt nii SFV kui ka temaga suguluses oleva Sindbis-viiruse uurimisel ning hiljem ka meditsiiniliselt tähtsa Chikungunya viiruse uurimisel. Nende viiruste võrdlev analüüs võimaldab välja selgitada alfaviiruste replikatsioonis ja viirus-peremees interaktsioonides toimivad üldised ja fundamentaalsed printsiibid, millest osad võivad olla universaalsed ja kehtida kõigile positiivse polaarsusega RNA viirustele.
The mosquito-borne alphaviruses are potent emerging pathogens, as demonstrated by the recent Chikungunya virus outbreak around the Indian Ocean. Vectors and replicons based on alphaviruses are also increasingly important for their use in biotechnology, gene therapy and vaccination. We propose a plan to generate advanced molecular tools which can be used for search for inhibitors, and to further understand the basic mechanisms of alphavirus replication and virus-host interactions. In alphavirus infected cells, replication of viral RNA takes place on membrane-associated structures, a common feature of positive-strand RNA viruses. At the fundamental level, we wish to understand how these replication structures arise from the presumably complex interactions of viral and host proteins and other components (such as lipids, nucleic acids etc). This analysis can reveal novel targets for antiviral action, relevant not only to alphaviruses but to virus infections beyond the alphavirus group (including large group of alpha-like positive-strand RNA viruses and other positive-strand RNA viruses). A central regulator of alphavirus RNA replication is the specific virus-encoded protease nsP2 which cleaves the replicase polyprotein into functional subunits. Taking advantage of our mapping of the nsP2 protease recognition sequences, we have successfully inserted eGFP marker (as well as other sensitive markers) genes into the virus polyproteins, non-structural and structural. These viruses are viable, have phenotypes similar to the wt virus. To quantify the virus replication in assays for inhibitors viruses containing luciferase will be engineered. For imaging at the electron microscope and fluorescence microscope of in vitro and in vivo infected cells and tissues, horse radish peroxidase and fluorescent proteins will be inserted into the virus; different tags will be inserted for purification of the host components bound to viral proteins. These approaches will be explored in parallel in two well-studied alphaviruses Semliki Forest virus and Sindbis virus and will be extended to the emerging Chikungunya virus. Comparative studies of these viruses will discover general and fundamental principles of alphavirus replication and virus-host interactions which may be relevant to other positive-strand RNA viruses and the marker viruses generated will provide tools which we will exploit to screen for novel inhibitors of virus replication.