See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9410
ETF9410 "Rasvappedioksügenaaside ekspressioon ja oksülipiinide süntees korallis stressitingimustes (1.01.2012−31.12.2015)", Nigulas Samel, Tallinna Tehnikaülikool, Matemaatika-loodusteaduskond.
ETF9410
Rasvappedioksügenaaside ekspressioon ja oksülipiinide süntees korallis stressitingimustes
Expression of Fatty Acid Dioxygenases and Oxylipin Synthesis in Coral Stress
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt50,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP340 Lipiidid, steroidid, membraanid 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt50,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201217 400,00 EUR
01.01.2013−31.12.201317 400,00 EUR
01.01.2014−31.12.201417 400,00 EUR
01.01.2015−31.12.201517 400,00 EUR
69 600,00 EUR

Vastuseks erinevate stressifaktorite toimele sünteesivad paljud mere- ja maismaaorganismid sekundaarseid metaboliite, sealhulgas oksülipiine. Imetajates osalevad prostaglandiinid ja leukotrieenid raku homeostaasis, paljunemises ja diferentsieerumises, kuid samuti mitmetes patoloogilistes protsessides nagu põletik ja vähkkasvajad. Taimedes moduleerivad jasmonaadid stressivastust, kuid ka kasvu ja arengut. Kuigi oksülipiinide leidumine on tõestatud mitmetes mereselgrootutes, sealhulgas korallid, on vähe teada nende ühendite biosünteesiradadest ja funktsioonidest neid tootvates organismides. Korallid, olles kliimamuutuste suhtes ühed enimohustatud organismid, on ühtlasi unikaalsed oksülipiinide sünteesi kompleksuse seisukohast. Kui lipoksügenaasid (LOX) ja alleenoksiidi süntaas (AOS) on võtmeensüümideks taimedes ning LOX ja tsüklooksügenaas (COX) selgroogsetes loomades, siis korallis eksisteerivad kõrvuti mõlemad nii COX kui LOX/AOS rajad. Koralli COX katalüüsib prostaglandiinide sünteesi arahhidoonhappest, kuid alleenoksiidi metaboolne saatus ning füsioloogiline roll korallides on teadmata. Käesoleva taotluse eesmärgiks on kontrollida meie hüpoteesi, et oksülipiinide sünteesitaset korallis mõjutavad erinevad stressitingimused. Uurimaks stressifaktorite mõju oksülipiinide sünteesile ning vastavate geenide transkriptsioonitasemele plaanime läbi viia katsete seeria isoleeritud Capnella sp. kolooniatel meie labori mereakvaariumis. Meie peamised tööhüpoteesid on järgmised: (i) endogeensete oksülipiinide koosseis ja hulk on mõjutatud selliste abiootsete stressifaktorite poolt nagu mehaaniline vigastamine või kõrgenenud temperatuur; (ii) vähemalt mõned oksülipiinide geenidest indutseeritakse stressitingimustes; (iii) korallis eksisteerib kaks teed oksülipiinide taseme tõstmiseks: kiire vastus ensüümide, näiteks LOX, aktiveerimise teel ning aeglane vastus läbi geenide (kodeerivad oksülipiinide sünteesi eest vastutavaid ensüüme) ekspressiooni indutseerimise. Seniste uuringute käigus oleme korallis Capnella identifitseerinud kaks COX, ühe LOX ja kaks AOS-LOX geeni järjestust. Samuti näitasid esialgsed qRT-PCR uuringud, et vähemalt ühe AOS-LOX ekspressioon referentsgeeni suhtes suurenes vastusena koralli mehaanilisele vigastamisele. Ülaltoodud hüpoteeside kontrollimine ongi käesoleva taotluse peamiseks eesmärgiks.
Many marine and terrestrial organisms have shown to synthesize secondary metabolites including oxylipins in response to different stress factors. In mammals, prostaglandins and leukotrienes are involved in cellular homeostasis, proliferation, and differentiation, and also in pathological processes like inflammation and cancer. In plants, jasmonates and green leaf volatiles mediate stress response, as well as growth and development. Although the ocurrence of oxylipins has been documented in marine invertebrates including coral, very little is known about their biosynthetic routes and functional significance in the animals producing the compounds. Corals being among most impacted organisms by climate change stress are also unique by its complexity of oxylipin biosynthetic pathways. While lipoxygenases (LOX) and allene oxide synthase (AOS) are the key enzymes in plant, and LOX and cyclooxygenases (COX) in vertebrate animals, coral utilizes both COX and LOX/AOS pathways of oxylipin synthesis. The coral COX transforms arachidonic acid into classical prostaglandins but the metabolic fate and biological roles of allene oxide in coral cells are totally unknown. The current proposal is addressed to verify our hypothesis that the synthesis of oxylipins in coral may be affected by stress. To investigate the changes in oxylipin synthesis and trancription of their biosynthetic genes in response to stress, a series of experiments will be conducted on isolated colonies of Capnella sp. This soft coral is routinely cultivated and propagated in our lab aquarium. Our main working hypotheses are: (i) the spectrum and amount of endogenous eicosanoids are influenced in responses to abiotic stressors such as mechanical injury or thermal stress; (ii) at least some of the oxylipin genes are inducible and up-regulated under stress conditions; (iii) coral uses two ways to increase the level of eicosanoids: fast response through activation of fatty acid dioxygenases, e.g. LOX enzymes, as well as slow response through up-regulation of inducible genes encoding for the enzymes responsible for eicosanoid synthesis. In course of preliminary studies with Capnella we have identified already five oxylipin-related genes - two for COX, one for LOX and two for AOS-LOX. Initial qRT-PCR experiments revealed that at least one of the two AOS-LOX genes is up-regulated in response to artificial wounding. Main objectives of the proposal are to verify the above mentioned hypotheses.
Stressitingimustes sünteesivad paljud organismid sekundaarseid metaboliite, sealhulgas oksülipiine. Käesoleva projekti raames uuriti, millised muutused leiavad aset koralli oksülipiinide sünteesiradades vastuseks levinud stressoritele nagu mehhaaniline vigastamine ja kõrgenenud veetemperatuur. Korallist Capnella imbricata kloneeriti ja ekspresseeriti kaks AOS-LOX isovormi, AOS-LOXa ja AOS-LOXb, mille aminohappejärjestused on identsed 88% ulatuses. Kui AOS-LOXa produktidena identifitseeriti oodatult α-ketool ja tsüklopentenoon, vastavalt 70 ja 14%, siis AOS-LOXb toimel tekkisid arahhidoonhappest (AA) ainult tundmatud polaarsed ühendid (UPC) (90%). Stressi mõju uurimiseks määrati C. imbricata AOS-LOX-i isovormide mRNA tasemed ning vastavate valkude poolt sünteesitud metaboliitide sisaldus nii normaalolekus kui stressi tingimustes. Vigastamise järgselt suurenes eksogeense AA konversioon α-ketooliks, samal ajal kui UPC sisaldus langes. Lõikehaava lähedal täheldati AOS-LOXa ekspressioonitaseme märkimisväärset tõusu juba üks tund peale vigastamist. Samas, AOS-LOXb ekspressioonitase ei muutunud. Sarnane stressivastus ilmnes ka termilise stressi puhul. Seejuures, kui suurem tõus AOS-LOXa geeniekspressioonis detekteeriti vastuseks nõrgemale stressile, siis kõrgem α-ketooli tase mõõdeti kõrgema temperatuuri elik tugevama stressi korral. Positiivse stressiindikaatorina kasutati koralli kuumašoki valke, Hsp70 ja Grp78. Tuginedes saadud tulemustele ja kirjanduse andmetele pakuti välja skeem AOS-LOX võimalikust kohast koralli stressivastuses, kus Hsp70 vahendab oksüdatiivset ja termilist stressi, Grp78 ER stressi ning AOS-LOXa produktid osalevad üldise stressivastuse vahendamise esmases faasis. Seejärel identifitseeriti UPC kui 8-oksoheksaeenhape, mille ensüümkatalüütiline süntees arahhidoonhappest tõestab esmakordselt seni ainult taimedes detekteeritud hüdroperoksiidi lüaasi (HPL) aktiivsuse olemasolu loomades.