"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9185
ETF9185 "Käsna ja mikroobi sümbioosi funktsionaalsed aspektid puriinide põhiainevahetuse näitel (1.01.2012−31.12.2015)", Merike Kelve, Tallinna Tehnikaülikool, Matemaatika-loodusteaduskond.
ETF9185
Käsna ja mikroobi sümbioosi funktsionaalsed aspektid puriinide põhiainevahetuse näitel
Functional aspects of sponge-microbial symbiotic relationsip: contribution of basic purine metabolism
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201217 400,00 EUR
01.01.2013−31.12.201317 400,00 EUR
01.01.2014−31.12.201417 400,00 EUR
01.01.2015−31.12.201517 400,00 EUR
69 600,00 EUR

Projekt käsitleb puriinide ainevahetust kõige vanemates praegu elavates hulkraksetes loomades – käsnades, kusjuures erilise tähelepanu all on puriinide de novo biosünteesi tee ja seda säästvad rajad (salvage pathways). Esimese, 2010. aastal avaldatud käsnagenoomi – merekäsna Amphimedon queenslandica genoomi – analüüsimisel avastasime, et selles puudub üks põhiainevahetuse rada, nimelt puriinide de novo süntees. Meie andmetel on see esimene näide puriinide de novo sünteesi puudumise kohta mitteparasiitse eluviisiga organismis. Saadud tulemuse üldistamiseks plaanime käesoleva projekti raames uurida puriinide metaboolseid radasid erinevatesse perekondadesse, sugukondadesse ja isegi erinevatesse klassidesse kuuluvates käsnades. In silico analüüsiks kasutame olemasolevaid EST andmebaase ja lõpetamist ootavate käsnagenoomide andmeid. Puriinide de novo sünteesi eest vastutavate geenide eksperimentaalseteks otsinguteks erinevatest käsnadest kasutame geeniamplifikatsiooni meetodeid konsensusjärjestuste alusel disainitud praimerite abil. Tulemustest sõltuvalt kulgeb edasine töö võimalike käsnade puuduvat ainevahetusrada kompenseerivate sümbiontsete mikroorganismide identifitseerimise suunas ja/või vastavate käsnageenide identifitseerimise ja fülogeneetilise iseloomustamise suunas. Projekti eesmärk on näidata, et käsna ja mikroobi tõelise sümbioosi vajadus on määratud põhiainevahetuse tasemel. Projekti teine eesmärk on selgitada meie poolt käsnades avastatud kõrge aktiivsusega nukleotiide metaboliseerivate ensüümide roll puriinnukleotiide sünteesi säästvates ja nende korduvkasutuse protsessides. Erilise tähelepanu all on uus ensüüm ATP N-glükosidaas koos tuntud ensüümi ADP ribosüültsüklaasiga (viimase eripäraste omaduste tõttu käsnas). Samuti jätkame 2’,5’-oligoadenülaatsüntetaaside ja hiljuti leitud 2’,5’-spetsiifilise ribonukleaasi kui potentsiaalsete puriinide sünteesi säästmisega seotud ensüümide uuringuid ning alustame puriinide metüülimise/demetüülimisega seotud ensüümide otsinguid käsnades. Meie esmased andmed näitavad, et kõik need ensümaatilised aktiivsused avalduvad erinevates käsnaliikides erinevalt.
The present application relates the purine metabolism in sponges with a particular emphasis on the salvage pathways of adenine nucleotides in the most ancient Metazoa, the sponges. Analyzing the first draft genome sequence for a demosponge Amphimedon queenslandica in 2010 we discovered the lack of a basic metabolic pathway, the purine de novo synthesis, in this genome. This is by our knowledge a first demonstration of the inability for de novo purine synthesis by an organism whose life style is not parasitic. We will now extend the analysis of purine metabolic pathways to other sponges belonging to different genera or even to different classes. For in silico analysis we will use the available EST databases and several sponge genomes to be published in the nearest future. In parallel the genes for the enzymes of the purine de novo synthesis pathway will be amplified from a number of sponge species. Depending on the results either the particular symbiotic organism responsible for complementation of the missing pathway will be identified and/or the respective sponge genes will be identified and phylogenetically characterized. The idea of the project is to prove on the molecular level that true sponge-microbial symbiosis is determined at the level of basal metabolism. Another aim of the project is to prove the roles of nucleotide metabolic enzymes discovered by us and having high activity in sponges, in salvage and recycling processes of purine nucleotides. Special attention will be paid to the novel enzyme ATP N-glycosidase together with a known enzyme ADP ribosyl cyclase that shows special features in sponges. The potential salvage enzymes of interest to us include 2’,5’-oligoadenylate synthetases together with a novel 2’,5’-specific ribonuclease; and the enzymes related to methylation/demethylation on purines. Our preliminary observations refer to a diverse activity of these enzymes in the phylum Porifera depending on the particular sponge species.
Projekt käsitles puriinide ainevahetust kõige vanemates praegu elavates hulkraksetes loomades – käsnades, kusjuures erilise tähelepanu all oli puriinide de novo biosünteesi tee ja seda säästvad rajad (salvage pathways). Esimese avaldatud käsnagenoomi – Amphimedon queenslandica – analüüsimisel avastasime, et selles puudub üks põhiainevahetuse rada, puriinide biosüntees. Meie andmetel on see esimene näide puriinide de novo sünteesi puudumise kohta mitteparasiitse eluviisiga organismis. Projekti eesmärk oli näidata, et käsna tõelise sümbioosi vajadus on määratud põhiainevahetuse tasemel. Uurisime läbi andmebaasid kõigi puriinide metabolismis osalevate ensüümide geenide ja/või nende transkriptide esinemise ja mitmekesisuse kohta käsnades. Alustasime puriinide de novo biosünteesi radade võtmeensüüme kodeerivate järjestuste otsinguid mageveekäsnast Ephydatia muelleri. Puriinnukleotiidide sünteesi säästvates ja nende korduvkasutuse protsessides osalevate ensüümide uurimine keskendus kahele ensüümile. Meie poolt avastatud ATP N-glükosidaasset aktiivsust omava valgu identifitseerimiseks lähtusime andmetest nukleotiidfosforülaas/hüdrolaaside perekonna ensüümide kohta. Kloneerisime käsnast E. muelleri võimaliku ATP N-glükosidaasi kodeeriva kandidaatgeeni, ekspresseerisime selle ja tõestasime tema oodatava ensümaatilise aktiivsuse. Tulemused on valmis avaldamiseks. Teiseks avastasime käsnades uut tüüpi ensüümi - spetsiifilise 2',5'-endoribonukleaasi, mille puhastasime käsnaekstraktist ja iseloomustasime biokeemiliselt. Võimalik, et uus ensüüm kuulub 2',5'-spetsiifiliste ribonukleaaside rühma, mis hoiavad 2',5'oligoadenülaatide rakulist taset kontrolli all (s.h. ka imetajates). Näitasime, et käsnade 2',5'-oligoadenülaatsüntetaasid (OAS) erinevad oluliselt imetajate vastavatest ensüümidest: käsnade OAS katalüüsib lisaks 2’,5’sideme tekkele ka 3’,5’-fosfodiestersideme teket. See mittespetsiifilisus võib olla tingitud selle ensüümi aktiivtsentri struktuuri ehituse eripärast, aga samas võib reaktsiooni 2’- või 3’-spetsiifilisust suunata ka aktivaatorina kasutatav RNA.