See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9438
ETF9438 "Uued meetodid therapeutikumide raku spetsiifiliseks sisestamiseks (1.01.2012−1.12.2015)", Julia Uusna, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Tehnoloogiainstituut.
ETF9438
Uued meetodid therapeutikumide raku spetsiifiliseks sisestamiseks
New Methods for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Molecules
1.01.2012
1.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ValdkondAlamvaldkondCERCS erialaFrascati Manual’i erialaProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP320 Nukleiinhappesüntees, proteiinisüntees 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201211 610,00 EUR
01.01.2013−31.12.201311 610,00 EUR
01.01.2014−31.12.201411 610,00 EUR
01.01.2015−31.12.201511 610,00 EUR
46 440,00 EUR

Kuna sünteetilised biomolekulid (RNA-d, splaisi korrigeerivad oligonukleotiidid ja nende modifitseeritud analoogid) leiti olema edukad spetsiifiliste geenide moduleerimisel, siis on sellest ajast peale suurenenud huvi ka therapeutikumide vastu, mis põhinevad nukleiinhapete uuringutel. Geeni funktsiooni inhibeerimist, kus kasutatakse kas antisenset või antigeeni, on paljudes töödes hinnatud. Lisaks oligonukleotiididele, mis inhibeerivad geenide funktsiooni on ka kasutatud laialdaselt siRNA-d. Seda protsessi nimetatakse RNA interferentsiks, millele omistati ka Nobeli preemia 2006. aastal. Sellise geenitheraapia laialdane kasutamine on aktuaalseks saamas ka kliinikus ja kasutatakse just tänu järjest paremate tehniliste meetodite täiustamisel, kaasa arvatud uute transport vektorite ja sihtmärk addreseeritud molekulide koe-spetsiifiliseks transpordil. Käesolevatel aastatel on näidanud suurt edu mitte viiruslikud transport vektorid, mille kaudu on võimalik geeni ekspressiooni modifitseerida, eriti mRNA-d, mis on primaarseks või sekundaarseks sihtmärgiks. See projekt kontsentreerub uute rakku penetreeruvate peptiidide (RPP) disainil ja sünteesil, mida saab kasutada kui „üldiseid transportvektoreid“ nukleiinhapete transpordiks. Neid RPP vektoreid võib kovalentselt või mitte kovalentselt konjugeerida erinevate nukleiinhapetega või disainitud ainetega, selleks et uurida nii raku penetreerumist kui ka farmakoloogilisi efekte tähtsates bioloogilistes süsteemides. Plaanis on selliseid RPP konjugeeritud ainete efekte uurida ka mitmesugustes inimhaiguste raku mudelites. Käesoleva töö eesmärgiks on arendada meetodeid koe-spetsiifiliseks transpordiks, mille sihtmärgiks on geene reguleerivate nukleiinhapete kasutamine anti-apoptootiliste valkude ekspressiooni reguleerimisel. See projekt peamiselt toetub uute meetodite arendamisele, mis on seotud RPP-ga, mille kaudu saab geene reguleerida oligonukleotiididega, sh. lühikesed interfereeruvad RNA-d, spetsiifilised addreseeritud tagid konjugaatide koe spetsiifiliseks transpordiks. Projektil on mitmesugune teaduslik väljund, kuna ta seob mitmesuguseid teadusharusid omavahel üheks tervikuks, nagu näiteks peptiidide, orgaanilise keemia, bio- ja neurokeemia, molkulaarbioloogia, rakubioloogia ja looma vähi mudel uuringud.
Ever since synthetic biomolecules (RNAs, splice correcting oligonucleotides and their modified analogues) were found to be successful in modulating functions of specific genes, the research on nucleic acid (NA) based therapeutics was intensified. Inhibiting gene functions by acting either as antisense or antigene has been evaluated in several studies. The siRNAs are recent additions to oligonucleotide analogues that inhibit gene function. The process is known as RNA interference (RNAi) and was awarded 2006 Nobel Prize in medicine. The widespread clinical use of this genetic therapy relies upon major technical improvements, including new delivery vehicles and address tags for tissue specific cell delivery. Non-viral delivery of gene expression modifiers, especially with mRNA as primary or secondary target, has shown great promise in recent years. This project will concentrate on design and synthesis of new cell-penetrating peptides, CPPs, that can be used as ´generalized vehicle´ for nucleic acid delivery. Then these CPP vectors will be covalently/non-covalently conjugated with different nucleic acids/established drugs in order to study both cellular uptake and pharmacological effects in relevant biological systems. The effect of a CPP-drug conjugate in cellular models for human disease will be also studied. The aim is to develop methods for tissue specific delivery of gene regulating nucleic acids targeting anti-apoptotic protein expression machinery. The core of the project is novel method development of linking cell penetrating peptides, gene regulating ONs, e.g. short interfering RNA and address tags for tissue specific delivery into a conjugate. The address tags to be evaluated are the homing peptides. This project has a strong multidisciplinary character which falls into a special importance area of science, since it brings together a wide area of expertise including peptide/organic chemistry, bio/neurochemistry, molecular biology, cell biology, and tumor model animals.
Projekti käigus disainisime uusi RSP-sid, teostasime sünteese ning tegime esmaseid analüüse, mille tulemuseks saime mitmesuguseid bioloogiliselt aktiivseid peptiide, mida nimetasime NickFectideks. Uute vektorite disainil lähtuti stearüleeritud transportan 10 peptiidist. Disaini eesmärgiks oli parandada peptiidse vektori võimet moodustada komplekse lastmolekulidega, suurendada komplekside sisenemist rakkudesse ja vabanemist endostütooti¬listest vesiikulitest. Käesoleva töö käigus selgus, et need uued stearüülitud transportan 10 analoogid, NickFecktid, on võimelised efektiivselt siduma erinevaid nukleiinhappeid, moodustades stabiilseid mittekovalentseid partikleid suurusega 62-160 nm. Uuringus on sünteesitud ja analüüsitud mitmeid peptiide, millest kõige efektiivsemateks osutusid NickFect1 (NF1) ja NickFect 51 (NF51). NF1 ja NF51 on võimelised efektiivselt vältima endosomeaalset lagundamist ning tõestasid oma rakendatavust in vitro. Järgnevalt viidi läbi in vitro katseid mitmes rakuliinis. NF1 ja NF51 olid rakukultuuri mudelis väga efektiivsed, kuid loomamudelis oli nende aktiivsus tagasihoidlik. Seega käesolevaid peptiidjärjestusi suunati edaspidiseks modifitseerimiseks, mille eesmärgiks oli peptiidi efektiivsuse tõstmine loomamudelis. Töö käigus muudeti peptiidi üldiste laengute jaotust ning kohendati amfipaatsust. Need modifikatsioonid ühendasid mõlema peptiidi NF1 ja NF51 positiivseid omadusi. Tulemuseks saadi 2 peptiidi NF17 ja NF55. Analüüside tulemuseks loomamudelis osutus kõige efektiivsemaks amfipaatne peptiid NF55, mis kompleksis pDNA-ga indutseeris kõige kõrgema geeni ekspressiooni kopsu, maksa ning aju kudedes. NF55 RSP-l on suur potentsiaal nukleiinhapete spetsiifiliseks edastamiseks erinevatesse kudedesse. Kokkuvõttes võime öelda, et käesoleva projekti raames disainitud ning sünteesitud peptiidid, NickFectid, mis on vähe toksi¬lised, sobivad nukleiinhapete transpordiks ning omavad head perspektiivi nii geeniteraapias kui ka valkude tootmises antud juhul kasutades Quattromed Cell Factory (QMCF) tehnoloogiat.