See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Eesti Teadusfondi uurimistoetus (ETF)" projekt ETF9458
ETF9458 "Maomürkide nukleaasid, nukleotidaasid ja fosfataasid. Struktuuri ja funktsiooni vahelised seosed (1.01.2012−31.12.2015)", Ene Siigur, Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituut.
ETF9458
Maomürkide nukleaasid, nukleotidaasid ja fosfataasid. Struktuuri ja funktsiooni vahelised seosed
Snake venom nucleases, nucleotidases and phosphatases. Structure-function relationships
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus (ETF)
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
AsutusRollPeriood
Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituutkoordinaator01.01.2012−31.12.2015
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201212 127,20 EUR
01.01.2013−31.12.201312 127,20 EUR
01.01.2014−31.12.201412 127,20 EUR
01.01.2015−31.12.201512 127,20 EUR
48 508,80 EUR

Laia biokeemilise, toksikoloogilise, füsioloogilise ja farmakoloogilise aktiivsusega maomürgid on olulised kui erineva bioloogilise funktsiooniga aktiivsete ühendite potentsiaalsed allikad. Projekti eesmärgiks on nukleotiide hüdrolüüsivate ensüümide – ribo- ja desoksiribonukleiinhapete, fosfodiesteraaside, 5`-nukleotidaaside, ATPaaside, ADPaaside, fosfomonoesteraaside – uurimine maomürkides. Need ensüümid on laialdaselt levinud pea kõikide madude mürkides. Paljud neist on eraldatud ja biokeemiliselt iseloomustatud. Sellele vaatamata pole selge, kas maomürk sisaldab individuaalseid DNaase ja ATPaase või on need aktiivsused fosfodiesteraasi lahutamatud omadused. Paraku puuduvad ka ensüümide strukturaalsed uurimused, kuna on isoleeritud vaid üks ekto-5`-nukleotidaasi kodeeriv cDNA Gloydius blomhoffii mürginäärme cDNA raamatukogust. Meie projekti esimeseks etapiks on ülalnimetatud ensüümide isoleerimine geelfiltratsiooni, ioonvahetuskromatograafia, afiinsus- ja/või hüdrofoobsuskromatograafia abil Vipera lebetina, V. berus beruse ja Naja oxiana mürgist. Valgud analüüsitakse elektroforeesi, isoelektrilise fokuseerimise, MALDI-TOF MS abil. cDNA isoleerimiseks vajaliku informatsiooni saamiseks sekveneeritakse N-lõpuline järjestus ja sisemised trüptilised peptiidid. V. lebetina mürgi ensüümide primaarstruktuur tuletatakse valku kodeerivate cDNA-de järjestusest, kasutades mürginäärme cDNA raamatukogu ja sekveneerides peptiide Edmani degradatsiooni ja LC-MS/MS abil. Valgu järjestuseks transleeritud cDNA järjestus annab informatsiooni proteoomika ja struktuuri-funktsiooni seoste uurimiseks. Suurt huvi pakuvad nukleaaside katalüütilisest aktiivsusest sõltumatud efektid. Edasine uurimistöö on seotud ensüümide farmakoloogiliste ja bioloogiliste omadustega, näiteks toime vereliistakutele, vere komponentidele, rakkudele jne.
Snake venoms, having a broad spectrum of biochemical, toxicological, physiological and pharmacological activities, are of biological interest as a potential source of active compounds of different function. The project is aimed at studying nucleotide-hydrolyzing enzymes in snake venoms comprising ribo- and deoxyribonucleases, phosphodiesterases, 5`-nucleotidases, ATPases, ADPases, phosphomonoesterases. These enzymes are ubiquitously distributed in almost all snake venoms. Many of them have been isolated and biochemically characterized. Despite of this it is not clear whether snake venom contains individual DNases and ATPases or these activities are inherent properties of phosphodiesterase. Unfortunately, structural studies of the enzymes are missing as well while only one cDNA encoding ecto-5`-nucleotidase from the cDNA library of Gloydius blomhoffii venom gland has been isolated. The first step of our studies will be isolation of the abovementioned enzymes by size exclusion, ion exchange, affinity and/or hydrophobic chromatography from Vipera lebetina, Vipera berus berus and Naja oxiana venoms. The proteins will be analysed using electrophoresis, isoelectric focusing, MALDI-TOF MS techniques. N-terminal and inner tryptic peptide sequencing will be used to get information for cDNA isolation. The primary structure of the enzymes from V.lebetina venom will be deduced from the cDNA encoding the protein using venom gland cDNA library and by primary sequencing of peptides using Edman degradation and LC-MS/MS techniques. cDNA sequence translated to protein sequence will give information for proteomic studies and for structure-function relationships. The effects of nucleases independent of catalytic activity would be of great interest. Further research will be connected with pharmacological and biological properties of the enzymes including effects on platelets, blood components, cells etc.
Nukleaasid on ensüümid, mis hüdrolüüsivad nukleiinhappeid ja nende derivaate. Nukleaasid jagunevad ekso- (fosfodiesteraas, PDE) ja endonukleaasideks (DNaasid, RNaasid). Nukleaasid on maomürkides laialt levinud, nende struktuur ja farmakoloogilised omadused on aga peaaegu tundmatud. Käesoleva projekti eesmärgiks oli nukleaaside, nukleotidaaside ja fosfataaside uurimine maomürkides. Geelfiltratsiooni, katioon- ja anioonvahetuskromatograafia abil isoleeriti gürsa (Vipera lebetina) mürgist fosfodiesteraasi isovorm molekulmassiga ~120 kDa ja 5´-nukleotidaasi homodimeer monomeeri massiga 60 kDa. PDE hüdrolüüsib ADP-d, kuid mitte ATP-d ja5´-AMP-d ja inhibeerib nii ADP kui kollageeni indutseeritud vereliistakute agregatsiooni doosist sõltuvalt. 5´-NT sisaldab lisaks homodimeersele ~120 kDa vormile ka molekulaarset vormi massiga >200 kDa (tri- või tetrameer) ja inhibeerib samuti vereliistakute agregatsiooni. Geelfiltratsiooni, ioonvahetus- ja afiinsuskromatograafia abil puhastati osaliselt RNaas H1 (~30 kDa) ja endonukleaas – DNaas- (~20 kDa). Gürsa mürginäärme cDNA raamatukogust isoleeriti täispikk fosfodiesteraasi kodeeriv DNA, 5´-kärbitud 5´-nukleotidaasi ja RNaas H1 kodeerivad DNAd. DNA-delt transleeritud aminohapete järjestused olid kooskõlas mürgist eraldatud valkude trüptiliste peptiidide vastavate järjestustega. Projekti olulisimad tulemused on PDE struktuuri määramine ja tõestus, et tegu on monomeerse valguga, 5´-nukleotidaasi kõrgmolekulaarse vormi avastamine gürsa mürgis, RNaas H1 avastamine ja osalise struktuuri määramine maomürgis, samuti madalmolekulaarse endonukleaasse DNaasi avastamine gürsa mürgis.