"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9114
ETF9114 "Mutageensed protsessid pseudomonaadides (1.01.2012−31.12.2015)", Maia Kivisaar, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF9114
Mutageensed protsessid pseudomonaadides
Mutagenic processes in pseudomonads
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.2. MikrobioloogiaB230 Mikrobioloogia, bakterioloogia, viroloogia, mükoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201217 400,00 EUR
01.01.2013−31.12.201317 400,00 EUR
01.01.2014−31.12.201417 400,00 EUR
01.01.2015−31.12.201517 400,00 EUR
69 600,00 EUR

Olukorras, kus bakterite paljunemine on takistatud, toimub bakteripopulatsiooni kiire adapteerumine muutunud keskkonnatingimustega bakterites tekkivate mutatsioonide teel. Pseudomonaadid on looduses laialt levinud bakterite rühm, kuhu kuulub nii patogeenseid kui ka mittepatogeensid liike. Kavandatud projekti peamiseks eesmärgiks on uurida bakterite geneetilise adapteerumise molekulaarseid mehhanisme keskkonnastressi tingimustes, kasutades mudelorganismina P. putida ja P. aeruginosa tüvesid. (1) Uurime erinevate DNA polümeraaside ja reparatsioonisüsteemide osalust pseudomoaadide mutatsiooniprotsessides. In vitro uuringutes võrdleme spetsialiseeritud DNA polümeraaside võimet lülitada nukleotiide erinevate DNA kahjustuste vastu. In vivo katsetes mõõdame mutatsioonisagedust ja määrame mutatsioonispektri erinevate DNA polümeraaside osas defektsetes tüvedes teatud DNA reparatsioonisüsteemide olemasolul ja puudumisel. Samuti uurime DNA replikatsioonil ja reparatsioonil osalevate valkude omavahelisi interaktsioone. (2) Uurime nukleoidiga assotsieerunud proteiinide (NAP) mõju mutatsioonide tekkele. Ennustame P. putida’s NAP-de (IHF, Fis, H-NS) seondumist uuritavatesse kromosoomi piirkondadesse in silico, kontrollime leitud saitide olemasolu in vitro seondumiskatsetega ja jälgime in vivo mutatsioonide teket uuritavates koromosoomi piirkondades, muutes kustlikult NAP-de ekspressioonitaset. Uuringud on ajendatud meie esialgsetest tulemustest, kus nägime, et punktmutatsionide sagedus ja spekter ning rekombinatsiooni toimumine on mõjutatud märklaua asukohast bakteri kromosoomis. (3) Saamaks terviklikumat pilti mutatsiooniprotsesside toimumisest bakterites, on meil plaanis otsida uusi geene, mis mõjutavad mutatsioonide teket. Selleks tekitame transposoonmutantide raamatukogu ja genoomse raamatukogu, kus kloneeritud geenid on üleekspresseeritud. Raamatukogusid sõelume testsüsteemi abil, mis võimaldab võrrelda mutatsioonisagedust üksikkolooniates (papillae assay) ning edasi lähtume kloonidest, kus mutatsioonisagedus on muutunud. Kavandatud uurimistöö selgitab bakterite evolutsioonimehhanisme looduslikes tingimustes, kus bakterite kasv on enamasti takistatud. Saadud tulemused aitavad mõista geneetilise kohastumise mehhanime, mis võimaldavad uute kataboolsete radade teket inimtekkeliste toksiliste ühendite lagundamiseks ning mehhanisme, mille alusel levivad patogeensed bakterid peremeesorganismi kudedes ja muutuvad resistentseks antibiootikumidele.
Under growth-restricting conditions bacterial populations can rapidly adapt to a new environment as a result of mutation. The genus Pseudomonas represents one of the prominent groups of bacteria including both pathogenic and non-pathogenic species. The main goal of this project is to study molecular mechanisms of genetic adaptation of bacteria under conditions of environmental stress by using P. putida and P. aeruginosa as model organisms. Specifically, the following research will be carried out: (1) Study of involvement of different DNA polymerases and DNA repair systems in mutagenic processes in. In vitro studies will include comparison of specialized DNA polymerases for their ability to incorporate nucleotides in front of various DNA lesions. In vivo studies will entail monitoring mutation frequency and spectrum of mutations in strains lacking various DNA polymerases in the presence or absence of particular DNA repair components. Protein-protein interactions of DNA replication and repair enzymes will be studied as well. (2) We will study impact of nucleoid-associated proteins (NAPs) in mutagenesis. The binding sites of NAPs (e.g., IHF, Fis, H-NS) flanking the studied regions in the chromosome will be predicted in silico, verified in in vitro binding assays, and mutagenic processes will be monitored in vivo at certain chromosomal regions by altering expression of NAPs. These studies are motivated by our preliminary results indicating that frequency and spectrum of point mutations and recombination events are affected by the chromosomal location of target DNA. (3) To expand the knowledge about entire network of mutagenic processes in bacteria, we are attempting to identify novel genes affecting mutagenic processes. Both random transposon mutagenesis of bacterial genome and screening of genomic library over-expressing cloned genes will be performed. Libraries will be screened for changes in mutation frequency in papillae assay enabling to compare mutation frequency in single colonies. Different environmental conditions and genetic backgrounds will be employed in screenings. The proposed research would be of importance to elucidate mechanisms of evolution of bacteria under growth-restricting conditions which is a common situation in natural environment. Also, this knowledge would be useful to understand basic mechanisms of evolution of new catabolic pathways, development of antibiotic resistance mutations, and evolution of pathogens during host invasion.
Selgitasime bakterite geneetilise adapteerumise mehhanisme keskkonnastressi tingimustes, kasutades mudelorganismidena baktereid Pseudomonas putida ja P. aeruginosa. Selgus, et bakteril P. putida on DNA alküülkahjustuste parandamiseks erinevaid üksteist komplementeerivaid süsteeme, millest AlkA glükosülaasi rada on üks olulisemaid kaitsemehhanisme tsütotoksiliste efektide eest, kuid mitte mutageensete efektide eest. DNA alküülkahjustuste tolereerimise eest vastutavad bakterites P. putida ja P. aeruginosa spetsialiseerunud DNA polümeraasid DnaE2 (ImuC) ja Pol IV (DinB), kusjuures DnaE2 viib läbi mutageenset ja Pol IV veavaba DNA alküülkahjustustest ülesünteesi (TLS). Konstrueerisime uue testsüsteemi selgitamaks kromosoomisisest homoloogilise rekombinatsiooni (HR) toimumist mõjutavaid protsesse pseudomonaadides. Selgus, et nukleotiidi väljalõike reparatsiooni (NER) valgud on bakteritele olulised ka „tavaolukorras“, kus DNA kahjustusi ei ole kunstlikult esile kutsutud. NER valkude puudumisel suureneb oluliselt HR-i sagedus ning väheneb rakkude eluvõime. Samas tekivad kiiresti kompensatoorsed mutatsioonid, mis taastavad bakterite normaalse kasvu ja vähendavad HR-i sagedust. UV-kiirgusest ja teistest DNA-d kahjustavatest teguritest põhjustatud DNA kahjustuste taluvust suurendab profaagide genoomide kõrvaldamine P. putida genoomist, mis ei ole aga seotud HR-ga. Mutatsioonide tekkel P. putida statsionaarse faasi rakkudes osalevad ka mittehomoloogilise ühendamise (NHEJ) valgud Ku ja LigD, kusjuures teineteisest sõltumatult. LigD ja Ku valkudega seotud mutageensete radade avaldumist reguleerib statsionaarse faasi sigma faktor RpoS. Kombineerides meie poolt konstrueeritud testsüsteemi, mis mille abil saame mõõta mutatsioonisagedust igas bakterikoloonias eraldi (papillide teke kolooniatel) ning transposoonmutageneesi, identifitseerisime bakteris P. putida mitmeid uusi mutatsioonisagedust mõjutavaid geene nagu näiteks truA, gacS ja mpl. Antud testsüsteem on rakendatav ka teistes pseudomonaadides, mis ei produtseeri levaani.