"Personaalne uurimistoetus" projekt PUT618
PUT618 "Mikro-RNA sekretsioon rakuvälistes vesiikulites ja RNA-ga seonduvates valgukompleksides (1.01.2015−31.12.2018)", Imre Mäger, Tartu Ülikool, Loodus- ja täppisteaduste valdkond, tehnoloogiainstituut.
PUT618
Mikro-RNA sekretsioon rakuvälistes vesiikulites ja RNA-ga seonduvates valgukompleksides
miRNA secretion in association with extracellular vesicles and RNA binding proteins
1.01.2015
31.12.2018
Teadus- ja arendusprojekt
Personaalne uurimistoetus
Stardiprojekt
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.12. Bio- ja keskkonnateadustega seotud uuringud, näiteks biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika, majandus- ja tehnoloogiauuringudT490 Biotehnoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt50,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.12. Bio- ja keskkonnateadustega seotud uuringud, näiteks biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika, majandus- ja tehnoloogiauuringudT360 Biokeemiatehnoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt50,0
PerioodSumma
01.01.2015−31.12.201560 000,00 EUR
01.01.2016−31.12.201660 000,00 EUR
01.01.2017−31.12.201760 000,00 EUR
01.01.2018−31.12.201860 000,00 EUR
240 000,00 EUR

Rakuväline RNA (exRNA) reguleerib organismis mitmeid bioloogilise protsesse. Rakuväiste vesiikulitega seonduv exRNA (EV-exRNA) vahendab infot rakkude/kudede vahel ning omab suurt terapeutilist potentsiaali (EV-exRNA koe-regeneratsiooni efektid ja refraktoorse GvHD patsiendi edukas ravi). Vesiikulitega mitte-seotud exRNA on vähem uuritud. exRNA terapeutilisi efekte saab täiendada, laadides nendesse soovitud RNAi molekule (miRNA, shRNA). See võimaldab täpsemalt uurida ka exRNA biodistributsiooni ja bioloogilisi efekte (tänu tundlikule RNAi-põhisele lugemile). Siiani on see olnud keeruline, kuna EV-exRNA mõjutab raskelt-uuritavaid geenivõrgustikke. Ma olen avastanud suurepärased viisid, kuidas laadida EV-exRNA-sse soovitud RNAi molekule, mis sisenevad sihtmärkrakkudesse efektiivsemalt kui seni. Käesoleva granditaotluse eesmärk on arendada RNAi laadimisviise edasi, täiendamaks exRNA bioloogia uurimiseks kasutatavaid meetodeid ja parendada selle terapeutilisi rakendusi.
Extracellular RNA (exRNA) mediates various biological processes in health and disease. Extracellular vesicle exRNA (EV-exRNA) is trafficked between cells/tissues, having tremendous therapeutic value, hallmarked by tissue regeneration effects and successful treatment of refractory GvHD patient. Non-vesicular exRNA is less studied. exRNA therapeutic effects can be augmented by loading it with desired RNAi molecules (miRNA, shRNA). The latter also allows more precise characterisation of exRNA biodistribution and biological functions because it enables access to sensitive RNAi-based readout. Until now this has been widely inaccessible because natural EV-exRNA affects gene networks which can be complicated to study. I have found excellent leads that enable to enrich desired RNAi-inducing RNA species in EVs, leading to their increased transfer between cells. This proposal aims to follow the leads further for developing improved tools for exRNA biology research and therapeutic applications.
Selles projektis uuriti rakuvälist miRNA-d, mis sekreteeritakse rakuvälistes vesiikulites (RV) ja valgukompleksides. Kasutades sekveneerimist, me näitasime, et rakuvälistes vesiikulites sisalduv miRNA hulk on tunduvalt väiksem kui valukompleksides sekreteeritud miRNA. miRNA üle-ekspresseerimine RV-sid tootvates rakkudes seda trendi ei muutnud, seda sõltumata sellest, kas miRNA-d ekspresseeriti naturaalseid või kunstlikke promootoreid kasutades. Proteoomikaeksperimendid näitasid, et miRNA hulk RV-des korrelleerus miRNA-ga seonduvate valkude hulgaga RV-des, mida leidus minimaalselt. Teatud miRNA-ga seonduvate valkude hulga suurendamine RV-des (kasutades selleks bioloogilise valgudisaini meetodeid) suureneb ka miRNA-de hulk RV-des. Need tulemused näitavad, et disainides RV-sid RNA-teraapiate transpordiks, on oluline keskenduda nii RNA kui valkude biodisainile. Lisaks sai loodud reporter-rakuliin, mille abil näitasime, et suure tõenäosusega on RV-de arendamisel ravimmolekulide kandjatena kaks olulist limiteerivat faktorit: miRNA laadimine RV-desse nende biogeneesi käigus ja miRNA-de vabastamine RV-dest pärast internaliseerimist sihtmäkrakkudesse. Need tulemused on olulised RV-de edasisesks arendamiseks paljulubavate RNA-l põhinevate ravimmolekulide toimetamiseks sihtmärkrakkudesse. Lisaks sellele aitavad saadud tulemused paremini aru saada sellest, läbi milliste mehhanismide võivad miRNA-d osa võtta rakkudevahelisest kommunikatsioonist erinevate haiguste korral (nt. vähk, mida on selles kontekstis uuritud palju). Erilist märkimist väärib selle projekti puhul suurte korrelatiivsete andmepakettide kogumine, mis võimaldab täpsemalt kõrvutada RV-de transkriptoome ja proteoome. Need tulemused võimaldavad edendada RV tehnoloogia edasiarendamist paljudes uurimislaborites ja biotehnoloogiaettevõtetes.