See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF8276
ETF8276 "11R-lipoksügenaasi katalüütiliste omaduste modifitseerimine (1.01.2010−31.12.2013)", Ivar Järving, Tallinna Tehnikaülikool, Matemaatika-loodusteaduskond.
ETF8276
11R-lipoksügenaasi katalüütiliste omaduste modifitseerimine
Modification of the catalytic properties of 11R-lipoxygenase
1.01.2010
31.12.2013
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
4. Loodusteadused ja tehnika4.16. Biotehnoloogia (loodusteadused ja tehnika)T360 Biokeemiatehnoloogia 2.3. Teised tehnika- ja inseneriteadused (keemiatehnika, lennundustehnika, mehaanika, metallurgia, materjaliteadus ning teised seotud erialad: puidutehnoloogia, geodeesia, tööstuskeemia, toiduainete tehnoloogia, süsteemianalüüs, metallurgia, mäendus, tekstiilitehnoloogia ja teised seotud teadused).100,0
PerioodSumma
01.01.2010−31.12.2010191 568,00 EEK (12 243,43 EUR)
01.01.2011−31.12.201112 243,60 EUR
01.01.2012−31.12.201211 631,60 EUR
01.01.2013−31.12.201311 631,60 EUR
47 750,23 EUR

Lipoksügenaaside (LOX) vahendusel toimuv küllastamata rasvhapete oksüdatsioon molekulaarse hapnikuga on esimeseks reaktsiooniks mitmete signaalmolekulide sünteesil, nagu leukotrieenid ja lipoksiinid loomades ning jasmoonhappe derivaadid taimedes. LOXide ja nende produktide bioloogiliste funktsioonide uurimisel on hädavajalik enantiomeerselt puhaste katalüüsiproduktide, s.o. hüdroperoksü- ja hüdroksürasvhapete, olemasolu ja kättesaadavus. Seetõttu on efektiivsete meetodite väljatöötamine vastavate ühendite saamiseks esmajärgulise tähtsusega. Taotleja eelmise grandiprojekti olulisemaks tulemuseks oli 11R-LOX puhastamise skeemi väljatöötamine, 11R-LOXi oksüdatsiooni spetsiifilisust ning Ca2+-sõltuvat membraansidumist kontrollivate mehhanismide esmaste seaduspärasuste väljaselgitamine ning ensüümi aktiivtsentris produkti regi- ja stereokontrolli omavate aminohapete väljaselgitamine. Käesoleva projekti peamiseks ülesandeks on w6-w9 pentadieensüsteemi omavate rasvhapete efektiivse oksüdatsiooni väljatöötamine 11R-LOX abil. Vajalike muudatuste tegemiseks puhastatakse ja kristallitakse 11R-LOX ja uuritakse Ca2+ vahendatud membraanseostumisest sõltuvat ensüümi aktivatsioonimehhanismi. Röntgen-struktuur analüüs annab väärtuslikku informatsiooni substraadi kanali, Ca-ioonide seostumise ja rasvhappe allosteeriliste sidumiskohtade kohta. Ca2+ sidumise afiinsuse muutmiseks on plaanis vahetada 11R-LOXis b-domeen ja/või modifitseerida oletatavaid Ca2+ sidumises hõlmatud aminohappeid. Ensüümi aktiivtsentris on plaanis teha produkti suurema puhtuse saamiseks aminohapete vahetusi. Modifitseeritud 11R-LOX tootmiseks on plaanis ensüümi geen viia Pichia pastoris sekreteeruvasse ekspressioonisüsteemi.
Oxygenation of polyunsaturated fatty acids with molecular oxygen by lipoxygenases (LOX) is a first step in the biosynthesis of chemical messengers like leukotrienes and lipoxins in animals and jasmonic acid derivatives in plants. For investigation of the biological role of LOX enzymes elaboration of efficient methods for preparation of enantiomerically pure oxygenation products, i.e. hydroperoxy and hydroxy fatty acids is of great importance. One solution for this problem is cloning, expression and purification of recombinant LOXes from suitable sources. The cloned enzymes allow scaling up the production of different LOXes applicable in biosynthesis of the corresponding H(P)ETEs. In our previous studies we have found from soft coral G.fruticosa a LOX with unique oxidation specificity at C-11 in R configuration. The main results of the applicant’s previous grant project were elucidation of amino acids of active site area controlling the product quality, initial scheme of purification and stabilization of the enzyme and first knowledge about Ca2+ mediated membrane binding mechanism of 11R-LOX activation. The main goal of the current project is to improve the catalytic oxidation of polyunsaturated fatty acids containing w6-w9 pentadiene system with 11R-LOX. To find the changes necessary to perform in 11R-LOX structure the investigations on purification, crystallization and Ca2+-dependent membrane binding will be performed. X-ray analysis of crystalline 11R-LOX gives the unique information about the fatty acid positioning in the substrate channel and about allosteric binding sites for fatty acid and Ca2+ ions in LOXes. The modification of the enzyme structure for increase of affinity of Ca2+ binding gives the possibility to use higher substrate concentrations without risk of precipitation of fatty acid in form of insoluble Ca2+ salt. The improvement of the 11R/15S positional specificity in 11R-LOX catalysis is planned to achieve through changes in expression and reaction conditions and site directed mutagenesis in the catalytic site. The development of secretory expression of the 11R-LOX in the Pichia pastoris system gives the highly technological approach for recombinant 11R-LOX production.