"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9421
ETF9421 "Alfaviiruse replikaasi komplekside makromolekulaarse ehituse analüüs valkude pinna mutatsioonilise skanneerimise, homoloogsete domeenide vahetamise ja valkude keemilise liitmise/mass-spektromeetria meetodite abil (1.01.2012−31.12.2014)", Valeria Lulla, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Tehnoloogiainstituut.
ETF9421
Alfaviiruse replikaasi komplekside makromolekulaarse ehituse analüüs valkude pinna mutatsioonilise skanneerimise, homoloogsete domeenide vahetamise ja valkude keemilise liitmise/mass-spektromeetria meetodite abil
Probing the macromolecular architecture of alphavirus replication complex using mutational scanning of protein surfaces, homologous domain swapping and crosslink/ms analyses
1.01.2012
31.12.2014
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.2. MikrobioloogiaB230 Mikrobioloogia, bakterioloogia, viroloogia, mükoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt34,0
3. Terviseuuringud3.1. BiomeditsiinB510 Nakkushaigused3.1. Biomeditsiin (anatoomia, tsütoloogia, füsioloogia, geneetika, farmaatsia, farmakoloogia, kliiniline keemia, kliiniline mikrobioloogia, patoloogia)33,0
4. Loodusteadused ja tehnika4.16. Biotehnoloogia (loodusteadused ja tehnika)T360 Biokeemiatehnoloogia 2.3. Teised tehnika- ja inseneriteadused (keemiatehnika, lennundustehnika, mehaanika, metallurgia, materjaliteadus ning teised seotud erialad: puidutehnoloogia, geodeesia, tööstuskeemia, toiduainete tehnoloogia, süsteemianalüüs, metallurgia, mäendus, tekstiilitehnoloogia ja teised seotud teadused).33,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201212 000,00 EUR
01.01.2013−31.12.201312 000,00 EUR
01.01.2014−31.12.201412 000,00 EUR
36 000,00 EUR

Enamik uutest viirushaigustest on põhjustatud vektorite abil levivate RNA viiruste poolt. Sellisteks on ka alfaviirused, mis on nüüdseks tänu Chikungunya viiruse epideemiale (viimase viie aasta jooksul enam kui 5 miljonit nakatunut) äratanud suurt tähelepanu. Alfaviiruste genoom on positiivse polaarsusega RNA, mille paljundamist viib läbi replikaasi kompleks (RK), mis moodustub mittestruktuurse liitvalgu proteolüütilise lõikamise vahevormidest ja neljast lõpp-produktist. Nende ensüümide aktiivsuseid on biokeemiliselt põhjalikult uuritud, kuid nende struktuuridest on teada vähe. Veel enam, RK sisestruktuur, mille määravad valk-valk kontaktid tema koostisesse kuuluvate valkude domeenide vahel ning valk-RNA kontaktid, on praktiliselt tundmatu. Samas pole kahtlust, et just selles struktuuris on peidus viiruse tõeline „isiksus“, millel on otsustav tähtsus genoomi paljundamisel, päriliku informatsiooni edasikandmisel ja muutumisel ning sellega viiruse eksistentsi tagamisel. Viiruste valgud omavad moodul-struktuuri: struktuursed ühikud, mis täidavad erinevaid ülesandeid, moodustavad keeruka võrgustiku. Alaniin skaneerimismutageneesi abil teeme kindlaks regioonid, mille kaudu seonduvad omavahel RK-sid moodustavad valgud: laetud aminohappejäägid (mis on tõenäoliselt seotud valk-valk interaktsioonidega) asendatakse alaniini-jääkidega; alfaviiruste vahel vahetada võib ka terveid funktsionaalseid domeene. Seejärel analüüsitakse adaptiivseid mutatsioone, mida viirus vastusena muudatustele tekitab. Andmeid, mis viitavad interaktsioonides osalevatele regioonidele, täiendame andmetega, mis saadakse nakatatud rakkudes paiknevate RK-de valkude keemilise liitmise (kasutades kindla pikkusega speiseritega reagente) ja saadud komplekside uurimisel mass-spektromeetria abil. Sellisel viisil identifitseeritud kontaktid annavad võimaluse hinnata valkude paiknemist RK koosseisus - teha kindlaks nende interaktsioonipartnerid ja nendevahelised kaugused. Seega, kombineerides otseseid ja kaudseid meetoodeid, määratakse alfaviiruse RK subühikuline koostis ja topoloogia, mis võimaldab saada ettekujutuse tema ruumilisest struktuurist, ning, mis on eriti tähtis, dünaamilistest muutustest, mis leiavad aset viiruse RNA replikatsiooni käigus. Valk-valk kontaktid on absoluutselt vajalikud RK moodustumisel, kooshoidmisel ja regulatsioonil. See informatsioon loob eelduse interaktsioonide kasutamiseks viirusinfektsiooni blokeerimisel.
Most of (re)emerging viral diseases are caused by the insect-borne RNA viruses. Previously neglected, alphaviruses are now in public focus due to recent epidemic outbreaks of Chikungunya virus, which affected over 5 million people during last five years. Alphaviral genome is a positive-strand RNA, replication of which is performed by replicase complex initially produced in a form of non-structural (ns) polyprotein, which becomes proteolytically matured in a temporally regulated manner to eventually release four ns-proteins. The enzymatic properties of the alphaviral ns-proteins are biochemically well explored, whereas structural analysis is lagging behind and the internal structure of alphaviral replication complexes, defined by spatial organization of interacting protein domains and topology of RNA-protein contacts, is left significantly understudied, although this undoubtedly comprises the viral “self” that is responsible for most vital tasks in viral replication, that safeguard the very existence of the virus and assure transmission of its heredity. Viral proteins are believed to be organized in highly modular fashion, whereas structural units with distinct functionalities are then intertwined to form complex networks. We plan to identify the binding hotspots between viral proteins through analysis of viral replication-caused mutations that emerge to compensate for the defects that we intend to introduce using alanine scanning of charged residues, which expectedly mediate protein-protein interactions, and domain swapping approach. We hope that these findings, strengthened with the results of mass-spectrometric analysis of cross-linked (with defined spacer arm linkers) sites within replicase complexes isolated from infected cells or sub-complexes reconstituted from co-expressed viral ns-proteins and/or their mutant variants, may provide useful information about physical contacts and proximity between proteins. By combining these direct and indirect methods for determination of stoichiometry and topology of subunits in replication complex we anticipate to get insight into configuration of viral replicase and provide hints for definition of its low-resolution structure and its transition states during course of viral replication. Importantly, identification of the interfacial contacts mostly contributing to integrity maintenance and regulation of alphaviral replication complex may provide new routes for interference into most intimate stages of infection.
Enamus projektis esitatud eesmärke on edukalt saavutatud. Konstrueeriti viirused, mille kodeeritud ns-liitvalgus asuvaid proteaasi lõikamiskohti muudeti alaniin-mutageneesi abil, saadud tulemused on avaldatud (Lulla et al., 2013). Teine osa projektist oli seotud protsessingu ajalise regulatsiooni ja selle funktsionaalse tähtsuse uurimisega biokeemiliste ning viroloogiliste meetodite abil (käsikiri on koostamisel). Viiruste, mille poolt kodeeritud valkude funktsionaalseid domääne oli omavahel vahetatud uurimine võimaldas välja selgitada need valkude regioonid, mille pinnad omavahel interakteeruvad (käsikiri on koostamisel).Lisaks sellele konstrueeriti stabiilselt ja ajutiselt SFV ja CHIKV valke ja liitvalke ekspresseerivad rakuliinid, mida kasutati viirus-peremees interaktsioonide uurimiseks. Konstueeritud on ka SFV ja CHIKV mutandid, mis kannavad kas spetsiifilisi defekte või/ja mille genoomi on sisse viidud visualiseerimist (ZsGreen ja mCherry) või afiinsus-puhastamist (SBP) võimaldavad tagid (kasutatud Pärn et al., 2013 töös). Olulist tähelepanu pöörati seni ebapiisavalt uuritud nsP2 valgu N-terminaalse regiooni funktsioonide analüüsile. Näidati, et see domään on oluline CHIKV nsP2 valgu RNA helikaasse aktiivsuse jaoks (Das et al., 2014).