"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF7884
ETF7884 "Ribosoomi subühikutevaheliste sildade funktsionaalne analüüs valgusünteesi translokatsioonitsüklis. (1.01.2009−31.12.2012)", Aivar Liiv, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond.
ETF7884
Ribosoomi subühikutevaheliste sildade funktsionaalne analüüs valgusünteesi translokatsioonitsüklis.
Functional characterization of individual ribosomal bridges: biochemical analysis of translocation step of ribosome cycle in bacteria.
1.01.2009
31.12.2012
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP320 Nukleiinhappesüntees, proteiinisüntees 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt50,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.3. GeneetikaB220 Geneetika, tsütogeneetika 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt50,0
PerioodSumma
01.01.2009−31.12.2009211 092,00 EEK (13 491,24 EUR)
01.01.2010−31.12.2010211 092,00 EEK (13 491,24 EUR)
01.01.2011−31.12.201113 491,60 EUR
01.01.2012−31.12.201213 491,60 EUR
53 965,68 EUR

Ribosoomi suure ja väikese subühiku vahelised kontaktid ehk sillad (B1-B8) on konserveerunud struktuursed elemendid, mis on kirjeldatud nii bakteri, pärmi kui ka imetaja mudelsüsteemides. Märkimist väärib sildade väga sarnane muster erinevates organismigruppides. Suur osa sildasid paikneb ribosoomi aktiivtsentri vahetus läheduses ning üksikutele sildadele on omistatud ka funktsionaalne roll (B1a, B2a). Teisest küljest on meie üldine arusaam sildade funktsionaalsetest rollidest peptiidahela sünteesil suures osas fragmentaalse iseloomuga. Translokatsioonitsükli seisukohast on intrigeerivaim küsimus ribosoomi subühikute omavaheline liikumine („rachet-like movement"), millega kaasneb peptidüül-tRNA ja mRNA suunatud liikumine ribosoomis. Ruumiliselt vaadatuna eeldab see dünaamilisi struktuurseid ümberkorraldusi sildades. Samas ei tea me milline on enamuse individuaalsete sillapositsioonide roll antud protsessis. Eelkatsete raames oleme konstrueerinud rea mutatsioone silla piirkondades, selgitamaks nende funktsioone in vivo. Lisaks oleme näidanud, et sild B2a osaleb ribosooni initsiatsiooni- ja elongatsioonitsüklis. Seega on alust oletada, et sildadel on täita universaalne roll ribosoomi tsükli korrektsel toimimisel. Käesoleva projekti põhieesmärgiks on ribosoomi sildade funktsionaalne kaardistamine translokatsioonitsükli kontekstis. Eksperimentaalne strateegia põhineb teadaolevate sillakontaktide muteerimisel ning mutatsioonide mõju hindamisel valgusünteesi translokatsioonitsükli erinevatele etappidele in vitro. Uurimistöö on jaotatud etappideks, mille alameesmärgid on: 1. selgitada, millised sillad on vajalikud aminoatsüül-tRNA faktorsõltuvaks ja faktor sõltumatuks translokatsiooniks; 2. iseloomustada ribosoomi sildade rolli aminoatsüül-tRNA hybriid-olekute tekkele ja stabiilsusele translokatsiooni esimeses etapis; 3. analüüsida sildade rolli faktorsõltuval ja faktor sõltumatul tagasitranslokatsiooni; 4. kirjeldada tRNA hybriid-olekute moodustumisega kaasnevaid lokaalseid struktuurseid muutusi ribosooni sildades. Töö põhihüpotees seisneb selles, et ribosoomi subühikute vahelised sillad on vajalikud funktsionaalse 70S ribosoomi moodustumiseks ja translatsioonitsükli korrektseks toimimiseks. Ribosoomi subühikute omavaheline kordineeritud liikumine ning konformatsioonilised muutused elongatsioonitsükli käigus on determineeritud ribosoomi väikse ja suure subühiku vaheliste sildade poolt.
The large and small subunits of the ribosome are joined by a series of bridges (B1-B8) that are conserved among mitochondrial, bacterial and eukaryal ribosomes. Most of the bridges are located in close proximity to the functional centres of the ribosome. According to structural models, several functions have been attributed to the bridging contacts. Bridges B2a and B1a have been shown to participate in ribosome cycle and being involved in initiation and elongation steps of ribosome cycle. On the other hand we know very little about the exact roles of majority of bridging contacts other than their roles during subunit association. The most intriguing aspect in this context concerns the intersubunit movement of the subunits during translocation (ratchet-like movement), during which peptidyl-tRNA and mRNA are translocated in the ribosome. During translocation, several bridges undergo structural changes. However, the functional roles of the bridges during ribosome cycle remain unclear. In our previous work, we analyzed the functions of bridges in a series of in vivo assays. We found that several bridge mutants affect cell growth and translational accuracy. Bridge B2a was found to be involved directly in initiation and elongation step of ribosome cycle. The aim of the current proposal is to create a functional map of bridges during translocation step of ribosome cycle. To clarify the role of the bridges we use systematic mutagenesis of bridging contacts. The impact of the individual bridges on ribosome cycle will be analyzed in a series of biochemical experiments in vitro. The questions in need of clarification are: 1. which intersubunit bridges are essential for factor-dependent translocation of tRNA in the ribosome? 2. What are the roles of bridges during factor-free translocation? 3. Which bridges modulate the hybrid-site formation during translocation cycle? 4. How the bridges affect the local structure of the translocating ribosome during hybrid-site formation. Answers to these questions will help us to create a model describing the roles of individual bridges during translocation step at molecular level. Our working hypothesis is that ribosomal bridges are functionally involved in initiation and elongation step and that ratcheting movement of ribosomal subunits during translocation cycle is directly regulated by intersubunit bridge contacts.