"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF8314
ETF8314 "Fluorestsensi anisotroopia rakendamine retseptorite uurimiseks (1.01.2010−31.12.2013)", Ago Rinken, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Keemia Instituut.
ETF8314
Fluorestsensi anisotroopia rakendamine retseptorite uurimiseks
Application of fluorescence anisotropy in studies of ligand binding to receptors.
1.01.2010
31.12.2013
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
4. Loodusteadused ja tehnika4.16. Biotehnoloogia (loodusteadused ja tehnika)T360 Biokeemiatehnoloogia 2.3. Teised tehnika- ja inseneriteadused (keemiatehnika, lennundustehnika, mehaanika, metallurgia, materjaliteadus ning teised seotud erialad: puidutehnoloogia, geodeesia, tööstuskeemia, toiduainete tehnoloogia, süsteemianalüüs, metallurgia, mäendus, tekstiilitehnoloogia ja teised seotud teadused).34,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt33,0
3. Terviseuuringud3.11. Terviseuuringutega seotud uuringud, näiteks biokeemia, geneetika, mikrobioloogia, biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika ja bioinformaatikaB120 Molekulaarne biofüüsika3.1. Biomeditsiin (anatoomia, tsütoloogia, füsioloogia, geneetika, farmaatsia, farmakoloogia, kliiniline keemia, kliiniline mikrobioloogia, patoloogia)33,0
PerioodSumma
01.01.2010−31.12.2010187 200,00 EEK (11 964,26 EUR)
01.01.2011−31.12.201111 964,00 EUR
01.01.2012−31.12.201211 964,00 EUR
01.01.2013−31.12.201311 964,00 EUR
47 856,26 EUR

Käesoleva projekti eesmärgiks uurida fluorestsentsi anisotroopia (FA) mõõtmisega G-valkudega seotud retseptoritele ligandide sidumise biokeemilisi regulatsioonimehhanisme. FA võimaldab ligandi seostumise protsessi otseselt jälgida ning ei nõua reaktsiooni tasakaalu mõjutavat retseptor-ligand kompleksi eraldamise etappi. See võimaldab ligandi sidumise reaktsioonide biofüüsikalised uurimised viia kvalitatiivselt uuele tasemele, aga oleks ka uute ligandide skriinimiseks vajaliku kõrgefektiivse katsesüsteemi aluseks. FA mõõtmiseks on vaja, et reporterligandiga on jäigalt seotud sobiv fluorofoor. Et vähendada täiendava struktuurielemendi mõju ligandi sidumisomadustele, võeti esimesteks märklaudadeks peptiidide retseptorid. Nendest peatähelepanu läheb melanokortiin 4 retseptoritele, mille igandid on meil juba olemas, ja neuropeptiid Y1 retseptoritele, mis funktsioneerimisel on tihti MC4R partner. Mõlemad retseptorid osalevad nii kehakaalu, seksuaalse käitumise kui ka mitme autonoomse funktsiooni regulatsioonil ja neid ekspresseeritakse ka samades neuronites. Katseloomade kudede membraanide fluorestsentsi kõrge baastase ei võimalda neid otseselt kasutada FA mõõtmistes. Esimese lahendusena planeerime konstrueerida viirused, mis genereerivad meid huvitavate retseptorite ja/või G valkude ekspresseerimise peremeesrakkudes piisavalt kõrge kontsentratsioonini (bakuloviirused Sf9 rakkudes, SFV CHO rakkudes), et neid saab kasutada FA mõõtmistes. Me oleme leidnud, et ka viirused, mis punguvad nakatatud rakkudest sisaldavad retseptoreid ja on FA mõõtmisteks isegi paremad kui rakud. Kas aga retseptorite omadused viirustes on samad, mis rakkudes, planeeritakse uurida projekti käigus. Olulise sammu edasi tahame astuda viirussarnaste osakeste tehnoloogia (VLP) kasutuselevõtuga, mis võimaldaks saada retseptoreid piisava kontsentratsiooniga spektroskoopilisteks uurimiseks sobivates osakestes, kuid seejuures säilitatakse retseptorite füsioloogiline lipiidne-valguline keskkond. Selleks oleme me saanud mutantse RSV-Gag plasmiidi ning koostöös selle looja prof. Wills-ga planeerime disainida retseptor/G valk süsteemid MC ja NPY retseptoritele. Kasutades loodavaid VLP-sid kui objekte ja fluorestsentsi anisotroopia mõõtmisi kui meetodit, loodame saada olulist uut informatsiooni ligandide sidumise mehhanismi kohta peptiidretseptorite korral, aga see oleks ka teiste retseptorite uurimis- ja skriinimissüsteemide loomise aluseks.
The aim of the project is to work out reliable assay system for characterization of ligand binding properties to G protein coupled receptors using fluorescence anisotropy (FA) measurements as detection system. FA enables direct, on-line monitoring of the reactions and do not require equilibrium-shifting separation step. This would be a challenge for fundamental biophysical studies, but also for generation of high throughput screening (HTS) assay system for receptors of interest. As the measurement of FA requires that reporter ligand has tightly coupled fluorophore and therefore peptide receptors having bigger ligands was selected as starting point for the development work. Melanocortin 4 receptors (MC4R), which have already fluoroligands available were selected as the first target of the project. To validate the assay system, and have better understanding in receptor regulation mechanisms, the neuropeptide Y1 receptors (NPY1R) were selected as an alternative target. Membranes from animal tissues cannot be directly used for FA measurements due their high basal background of fluorescence and therefore other sources has to be found. On the first step we propose to construct viruses, which generate the expression of the receptors and/or G proteins at high density in membranes of their target cells (for example baculoviruses insect Sf9 cell system or Semliki Forest Viruses in CHO cells). However, not only membranes of infected cells, but also viruses budding from cells after infections contain expressed receptors and would be suitable for ligand binding studies using FA, but do the binding parameters and regulatory mechanisms of receptors in viruses are the same as in natural membranes has to be studied within the project. A longer step forward would be the implementation of technology of virus like particles (VLP), which allows to obtain high concentration of receptors in physiological lipid-protein environment. We have obtained plasmid for mutant RSV Gag from Prof. Wills group at Pennsilvania State University and planning to design receptor / G protein VLP systems for MC4R and NPY1R. Taking VLP as material together with fluorescence anisotropy measurement as method we expect to obtain qualitatively new data about regulation of ligand binding to receptors and generate screening system of ligand binding properties for these receptors corresponding to high throughput requirements.