"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9072
ETF9072 "Pseudomonas syringae levaansukraasi struktuur ja funktsioon: alusuuringud ja biotehnoloogilised aspektid (1.01.2012−31.12.2015)", Tiina Alamäe, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF9072
Pseudomonas syringae levaansukraasi struktuur ja funktsioon: alusuuringud ja biotehnoloogilised aspektid
Structure-function analysis of levansucrase protein of Pseudomonas syringae: basic studies and biotechnological aspects
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.2. MikrobioloogiaB230 Mikrobioloogia, bakterioloogia, viroloogia, mükoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt34,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt33,0
1. Bio- ja keskkonnateadused1.12. Bio- ja keskkonnateadustega seotud uuringud, näiteks biotehnoloogia, molekulaarbioloogia, rakubioloogia, biofüüsika, majandus- ja tehnoloogiauuringudT490 Biotehnoloogia 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt33,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201212 000,00 EUR
01.01.2013−31.12.201312 000,00 EUR
01.01.2014−31.12.201412 000,00 EUR
01.01.2015−31.12.201512 000,00 EUR
48 000,00 EUR

Levaansukraasid (EC 2.4.1.10; kuuluvad glükosiidi hüdrolaaside (GH) perekonda 68) on bakterite rakuvälised ensüümid, mis lõhuvad sahharoosis glükosiidsideme ja kasutavad selle sideme energiat polümeerse fruktaani (levaani) ja fruktooligosahhariidide (FOS) sünteesiks. Nad sünteesivad näiteks kestoosi ja nüstoosi, mis on prebiootilise toimega. Levaansukraasid on struktuurselt sarnased GH32 ensüümidega – invertaasidega, inulinaasidega, levanaasidega ja taimede fruktaansüntaasidega. Seni pole selge, millised nende valkude piirkonnad määravad ära nende katalüüsi erisusi: sünteesitava sideme tüüpi, produkti pikkust, hüdrolüüsi võimet jne. Oleme kloneerinud ja ekspresseerinud bakteris E. coli kolm taimepatogeeni Pseudomonas syringae pv. tomato (Ps) levaansukraasi geeni – lsc1, lsc2 and lsc3. Ps nakatab tomatit ja Arabidopsist, levaansukraasi peetakse tema virulentsus- ja vastupidavusfaktoriks ning seda on seni peamiselt sellest aspektist uuritud. Ps levaansukraasi valgud on fülogeneetiliselt kauged teistest paremini uuritud levaansukraasidest nagu Gluconacetobacter diazotrophicus'e LsdA, Bacillus subtilis'e SacB ja Zymomonas mobilis'e LevU . Alustame Ps Lsc3 valgu struktuur-funktsioon analüüsiga. Eelnevalt oleme valgu puhastanud, seda biokeemiliselt iseloomustanud, kirjeldanud tema poolt erinevatest substraatidest sünteesitavaid produkte. Näitasime, et Lsc3 sünteesib ka FOSe ning on võimeline kasutama ebatavalisi fruktosüüli aktseptoreid, sünteesides heterooligofruktaane. Soovime edasi minna süvitsi – selgitada välja, millised valgu piirkonnad/aminohapped määravad ära Lsc3 katalüüsile omased jooned. Projektis käsitleme järgmisi probleeme: i) Lsc3 substraadispetsiifika ja polümerisatsioonireaktsiooni determinandid, ii) Lsc3 valgu alternatiivsed fruktosüüli aktseptorid ja sünteesitavad produktid; iii) aktiivtsentri aminohapped ja seostumispiirkonnad doonor- ning aktseptorsuhkrutele; iv) teised katalüüsi mõjutavad piirkonnad. Vastuseid otsime Lsc3 valgu mutantide tekitamisega, nende iseloomustamise ja analüüsiga. Ekspresseerime His-märgisega valgud E. coli’s ja puhastame. Iseloomustame mutantide biokeemilisi omadusi ja sünteesitavaid produkte, modelleerime Lsc3 valku ja otsime seoseid muteeritud valkude fenotüübi ja mutatsiooni asukoha vahel. Plaanime koostöös välispartneritega kristalliseerida Lsc3 valgu koos mõne ligandiga. Otsime Lsc3 mutantide hulgast biotehnoloogiliselt rakendatavaid variante näiteks FOSide või ka uudsete suhkrute sünteesiks.
Levansucrases (EC 2.4.1.10; family 68 of glycoside hydrolases) are bacterial extracellular enzymes that cleave the glycosidic bond of sucrose and use its energy to transfructosylate sucrose producing levan polymer and fructooligosaccharides (FOS) of biotechnological potential. For example, some levansucrases synthesize prebiotic FOS, kestose and nystose. Levansucrases have high structural similarity with GH32 enzymes - acid-type invertases, fungal and bacterial endo- and exo-inulinases, levanases and plant fructan synthesizing enzymes. Despite extensive research efforts, structural determinants for specific functions of GH68 and GH32 enzymes are not clear. For example, though considerably similar according to sequence and with highly similar structure, GH68 enzymes vary in catalytic properties: make either levan (b-2,6 linkages) or inulin (b-2,1 linkages), synthesize mostly FOS or long-chain polymer, mostly polymerize or hydrolyze. We have cloned and expressed in E. coli three levansucrase genes – lsc1, lsc2 and lsc3 of P. syringae pv. tomato which is a pathogen of tomato and Arabidopsis thaliana. Levansucrases of P. syringae are phylogenetically distant from thoroughly studied levansucrases – LsdA of G. diazotrophicus, SacB of B. subtilis and LevU of Zymomonas mobilis. Thus far levansucrases of P. syringae pathovars have been studied only from the aspect of fitness of the bacteria, biofilm formation and host plant pathogenesis. Previously we have biochemically characterized Lsc3 protein and the spectrum of polymerization products it produces from sucrose, raffinose and sugar beet molasses. We will proceed with characterization of Lsc3 protein by applying structure-function approach to elucidate the regions and specific residues of Lsc3 that are responsible for the catalysis and specific properties of the protein. By obtaining and thorough analysis of random and site-directed mutants of Lsc3 we will address following issues: i) substrate specificity, ii) the ability to synthesize FOS and levan polymer, iii) use of nonconventional fructosyl acceptors; iv) catalytic triad composition; v) residues implicated in acceptor binding; vi) 3D modelling of Lsc3 protein to support design of mutants and interpretation of the results. We also intend to crystallize the Lsc3 protein with its ligand, sucrose, raffinose or some nonconventional fructosyl acceptor. Hopefully, we will obtain also mutants that can be used for biotechnological purposes.
Tegelesime P. syringae pv tomato (Pst) levaansukraasidega Lsc3 (431 ah) ja Lsc2 (415 ah). Näitasime, et mõlemad levaansukraasid on nii järjestuselt kui ka katalüütilistelt omadustelt väga sarnased. Modelleerisime valkude struktuuri, ennustasime ja kontrollisime mutageneesiga katalüüsis olulisi positsioone. Tõestasime Pst Lsc3 ja Lsc2 valkude katalüütilise kolmiku aminohapped, vastavalt Asp62 (Asp46), Asp219 (Asp203) ja Glu303 (Glu287). Nende positsioonide asendusmutandid alaniiniga olid katalüütiliselt inaktiivseid. Põhjalikumalt analüüsisime Lsc3 valku, millel muteerisime üle valgu positsioone, mis olid piisavalt konserveerunud ja ennustuse kohaselt katalüüsis olulised. Valgumutantidel uurisime nende omadusi: substraadi lõhustamise ja polümeriseerimise aktiivsust, substraadispetsiifikat ja termostabiilsust. Näiteks selgus, et lisaks katalüütilisele kolmikule olid katalüüsis üliolulised Trp61, Trp109, His113, His321, Glu236, Gln301, Arg304, Asp333, Phe381 ja Val385. Kirjeldasime ka mutante (nt Glu146Gln; Thr302Met), millel oli FOS-ide sünteesi võime alanenud vähem kui sahharoosi lõhustamise võime. Neid saaks kasutada FOS-ide sünteesiks sahharoosist. Mutandid Phe323Ala, Phe323His ja Asp383Ala sünteesisid rafinoosist FOS-e enam kui algne Lsc3 valk. Lsc3 valgust saime kristallid, kuid need ei olnud piisavalt korrapärased. Parimaks saavutatud difraktsiooni väärtuseks kristallidel oli 4.5 Å. Kristalliseerimiseks sobivamam oleks Lsc2 valk, mis on kompaktsem - tal puudub 16 ah-pikkune liikuv domeen N-terminuses. Näitasime, et Lsc2 inaktiivsed mutandid sidusid sahharoosi, rafinoosi ja stahhüoosi, seega saaks neid võimaluse avanedes kristallida koos substraatidega, et kirjeldada valgu 3D struktuuri ja substraatide seondumist. Optimiseerisime ja rakendasime metoodika levaani ja FOS-ide sünteesiks Lsc3 valguga ning ka nende produktide puhastamiseks sadestamise, dialüüsi ja pärmitöötlusega. Näitasime, et saadud potentsiaalselt prebiootilisi produkte on võimelised kasutama jämesoolebakterid nii puhaskultuurina (Bacteroides thetaiotaomicron) kui ka soolekooslustes.