"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF8845
ETF8845 "Mitokondriaalse DNA replikatsiooni ja rekombinatsiooni vaheühendite analüüs pärmis S. cerevisiae (1.01.2011−31.12.2014)", Juhan Sedman, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF8845
Mitokondriaalse DNA replikatsiooni ja rekombinatsiooni vaheühendite analüüs pärmis S. cerevisiae
Analysis of replication and recombination intermediates in mitochondrial DNA of yeast S. cerevisiae
1.01.2011
31.12.2014
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ValdkondAlamvaldkondCERCS erialaFrascati Manual’i erialaProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP320 Nukleiinhappesüntees, proteiinisüntees 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2011−31.12.201117 400,00 EUR
01.01.2012−31.12.201217 400,00 EUR
01.01.2013−31.12.201317 400,00 EUR
01.01.2014−31.12.201417 400,00 EUR
69 600,00 EUR

Pagaripärm Saccharomyces cerevisiae on edukalt kasutusel olnud selliste geenide isoleerimisel, mille produktid osalevad mitokondriaalse DNA sünteesil ja segregatsioonil. Samal ajal on suhteliselt halvasti mõistetud see, kuidas nende faktorite koostöös tagatakse genoomi korrektne replikatsioon, millised on replikatsiooniprotsessi mehhanismi iseärasused ning milline on DNA vaheühendite topoloogia. Projekti raames planeerime analüüsida põhjalikult mitokondriaalse DNA replikatsiooni ning rekombinatsiooni vaheühendite topoloogiat kasutades Brewer- Fangmani tüüpi kahedimensionaalset agaroos-geelelektroforeesi. Püüame välja selgitada, millise mehhanismiga tagatakse metsikut tüüpi mitokondriaalse genoomi replikatsiooni initsiatsioon ning kas see protsess on seotud spetsiifiliste lookustega. Mitokondriaalse DNA vaheühendite topoloogia analüüsil lähtume esmalt kolmest võimalikust initsiatsiooni mudelist. Esiteks analüüsime andmete vastavust RNA poolt praimeeritud DNA sünteesi mudelile, teiseks initsiatsiooni toimumisele rekombinatiivsel teel ning kolmandaks sünteesi algustamisele üksikahelalise katke baasil. Lisaks DNA vaheühendite topoloogia analüüsile kahedimensionaalse geelelektroforeesi abil kasutame andmeid, mis saadakse struktuurispetsiifiliste ensüümide abil, in organello DNA sünteesi eksperimentes ning in vitro rekonstruktsioonikatsetes kasutades puhastatud valgulisi faktoreid.
The yeast Saccharomyces cerevisiae has widely been used for isolation of genes required for mitochondrial genome maintenance, however relatively little is known about the mechanism of replication and about topology of mitochondrial DNA intermediates. We will perform extensive characterization of mitochondrial DNA replication and recombination intermediates of the yeast Saccharomyces cerevisiae using Brewer-Fangman type 2-dimensional agarose gel electrophoresis. We would like to understand what mechanism drives the initiation of replication of the wild type mitochondrial genome in yeast, and if the initiation of DNA synthesis is associated with specific structures or sequence elements. The pattern of complex DNA intermediates will be analyzed within the framework of three different models, namely RNA primed initiation, recombination driven initiation and initiation from a single stranded nick. The analysis on 2-dimensional gels will be combined with different enzyme treatments, in organello labelling experiments and in vitro reconstitution experiments with purified protein factors.
Mitokondriaalse DNA (mtDNA) topoloogia topoloogia varieerub olulisel määral erinevates eukarüootsetes rakkudes, mis püstitab küsimuse kas DNA süntees toimub erinevate organismide mitokondrites ühesuguse mudeli kohaselt. Imetajate rakkudes toimub mitokondriaalse DNA süntees RNA praimeri poolt initseerituna. Meie poolt hiljuti analüüsitud pärmis Candida albicans valdab rekombinatiivne initsiatsiooni rada. Käesoleva töö raames oleme analüüsinud veel kahe erineva pärmiliigi, Saccharomyces cerevisae ja lineaarse mitokondriaalse genoomiga Candida parapsilosise mitokondriaalse DNA vaheühendite struktuuri. Kõikides analüüsitud mtDNA regioonides leidsime DNA struktuure, mis vastavad rekombinatsiooni vaheühenditele, ent ei leidnud tõendeid, mis viitaksid RNA transkriptide poolt initseeritud DNA sünteesile. Candida parapsilosise terminaalsed regioonid paistavad silma kui rekombinatsiooni kuumad punktid. Lisaks analüüsisime kahe mtDNA metabolismis osaleva ensüümi, mitokondriaalse DNA polümeraasi Mip1 ja kaksikahelalise DNA sõltuva ATPaasi Irc3 teatud struktuur-funktsioonaalseid aspekte. Tähelepanuväärsena põhjustab Irc3 geeni deleteerimine kaksikahelaliste katkete akumuleerumise GC rikaste blokkide juures mitokondriaalses genoomis, mis on tuntud kui aktiivse rekombinatsiooniga seotud lookused.