Poomisvastus (stringent response) on bakterite kohanemisvõime seisukohalt keskse tähtsusega protsess, mille toimimiseks vajaliku nukleotiidse signaalmolekuli, ppGpp taset reguleerivad RelA/SpoT-ga homoloogsed (RSH) valgud. Avastasime hiljuti, et E. coli RSH valgu RelA ppGpp-sünteesi aktiivsus, moodustades otsese positiivse tagasiside kontroll-elemendi, on tugevasti indutseeritud oma lõpp-produkti, ppGpp poolt. Kasutades kombinatsioone biokeemia, evolutsioon, mikroskoopia ja struktuuribioloogia meetoditest, on meie eesmärgiks vastata järgnevatele küsimustele. Esiteks, milline on ppGpp-sõltuva RelA aktivatsiooni molekulaarne mehanism? Teiseks, millised kolmekümnest RSH grupist on või ei ole ppGpp poolt reguleeritud? Kolmandaks, kuidas mõjutavad RelA aktiivsuse regulatsiooni interaktsioonid ribosoomi kompleksidega ja millised molekulaarsed tegurid selles osalevad? Neljandaks, kuidas avaldub ppGpp-vahendatud RelA regulatsiooni kineetika üksikraku ja populatsiooni tasemel?
The stringent response is a core adaptation mechanism in bacteria, mediated via changes in the intracellular concentration of the alarmone nucleotide ppGpp by RelA/SpoT Homologue (RSH) proteins. Recently we discovered that Escherichia coli RSH protein RelA’s ppGpp synthesis activity is strongly induced by its product, ppGpp, creating a direct positive feedback loop control element. Using a combination of biochemical, evolutionary, microscopic and structural approaches, we aim to answer the following questions: First, what is the molecular mechanism of RelA’s ppGpp-mediated activation? Second, which of the 30 groups of the RSHs are and are not regulated by ppGpp? Third, how is RelA’s interactions the ribosomal complexes translated into regulation of RelA’s activity and what are the molecular determinants involved? Fourth, how are the kinetics of ppGpp-mediated regulation of RelA manifested on the single cell and population levels?
Käesoleva töö eesmärgiks oli bakteriaalse poomisvastuse (stringent response) uurimine, kasutades kombinatsiooni biokeemia, fülogeneetilise analüüsi ja mikrobioloogia meetoditest. Töö tulemusel saime teada, et Enterococcus faecalis’e väike alarmooni süntetaas RelQ, ühe domeeni ja ribosoomist sõltumatu aktiivsusega (p)ppGpp süntetaas, on aktiveeritav reaktsiooni lõpp-produkti poolt (Gaca 2015 J. Bacteriology). Samuti avastasime RelQ ensüümi uudse omaduse, tegemist on RNA-ga järjestus-spetsiifiliselt seonduva valguga: (p)ppGpp-sünteesi aktiivsus on tugevasti inhibeeritud üheahelalise RNA-ga seondumisel ning (p)ppGpp, ensüümi allosteeriline aktivaator, töötab sellele inhibitsioonile vastu (Beljantseva 2017 PNAS). Mikrobioloogiliste uuringutega kirjeldasime poomisvastuse rolli nii Escherichia coli statsionaarsest kasvufaasist üleminekul eksponentsiaalsesse (Varik 2016 Scientific Reports) kui antibiootikumi tolerantsuse puhul (Kudrin 2017 AAC). Samuti proovisime erinevaid strateegiaid poomisvastuse inhibeerimiseks, kasutades keemiliste ühendite kogu (Andresen 2016 Scientific Reports, a), peptiidseid (Andresen 2016 Scientific Reports, b) ja nukleotiidseid (Beljantseva 2017 Scientific Reports) ühendeid. Meie ja teiste teadusgruppide tulemused paluti kokku võtta ülevaateartiklis bakteriaalse poomisvastuse evolutsioonist ja mehhanismidest (Hauryliuk 2015 Nature Reviews Microbiology).
Lisaks poomisvastuse paremale mõistmisele on projekt edendanud ka mitmeid seonduvaid valdkondi: bakteri ja mitokondri valgusünteesi mehhanismid ja evolutsioon (Kuzmenko 2016 Scientific Reports); antibiootikumide toimemehhanismid ja tolerantsus (Borg 2015 JBC).