"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF7421
ETF7421 "Nukleotiidide metabolismis osalevate ensüümide genoomse struktuuri ja aktiivsuse iseloomustamine madalaimates hulkraksetes loomades - käsnades (1.01.2008−31.12.2011)", Merike Kelve, Tallinna Tehnikaülikool, Matemaatika-loodusteaduskond.
ETF7421
Nukleotiidide metabolismis osalevate ensüümide genoomse struktuuri ja aktiivsuse iseloomustamine madalaimates hulkraksetes loomades - käsnades
Characterization of the genomic structure and activity of the enzymes involved in nucleotide metabolism in sponges, the lowest metazoa
1.01.2008
31.12.2011
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2008−31.12.2008348 000,00 EEK (22 241,25 EUR)
01.01.2009−31.12.2009334 080,00 EEK (21 351,60 EUR)
01.01.2010−31.12.2010334 080,00 EEK (21 351,60 EUR)
01.01.2011−31.12.201121 351,60 EUR
86 296,05 EUR

Käesoleva projekti eesmärk on välja selgitada kahe ebatavalise ATP konverteeriva ensüümi – 2’,5’-oligoadenülaatsüntetaasi (2-5A süntetaasi) ja ATP N-glükosidaasi – geenide struktuuri ja ekspressiooni alused kõige madalamates hulkraksetes loomades – käsnades. Käsnades täheldatava 2-5A süntetaasi ensümaatilise aktiivsuse erakordselt suure varieeruvuse selgitamiseks planeerime lisaks merekäsnale Geodia cydonium identifitseerida erinevat tüüpi ensümaatilise aktiivsusega käsnaliikide vastavad geenijärjestused, konstrueerides nende cDNA ja vajadusel ka genoomsed pangad. Merekäsnas G. cydonium määrame 2-5A süntetaasi paraloogsete geenide genoomsed struktuurid, nende omavahelise paiknemise ja sisalduse genoomis ning hindame nende ensümaatilist aktiivsust. Olles eelnevalt näidanud, et 2-5A sünteesi katalüüsiva ensümaatilise aktiivsuse kandjaks käsnas on valk/RNA kompleks, keskendume kompleksi RNA-komponendi identifitseerimisele ning selle panusele 2’,5’-fosfodiestersideme sünteesi amplituudi ja spetsiifilisuse määramisel (erinevalt imetajate vastavatest ensüümidest suudab käsna 2-5A süntetaas katalüüsida ka 3’,5’-fosfodiestersideme moodustumist). Olulise tähtsusega on meie poolt uuritavate ensümaatiliste aktiivsuste kandjate primaarstruktuuride väljaselgitamine peptiidjärjestuste tasemel (mis eeldab valgu väljapuhastamist looduslikust käsnast). See võimaldab hinnata meie poolt rekombinantse DNA tehnoloogia abil saadud tulemuste võimalikku piiratust 2-5A süntetaasi puhul, annab täiendavat teavet selle ensüümi isovormide ja ensümaatilises kompleksis oleva loodusliku RNA-komponendi kohta. Sama lähenemisviisi kasutame ka teiste meie poolt käsnas avastatud ensüümide – ATP N-glükosidaasi ja 2’,5’-spetsiifilise ribonukleaasi - geenide identifitseerimiseks. Järgnevad ATP N-glükosidaasi järjestushomoloogide otsingud erinevates käsnades ja teistes hõimkondades aitavad selgitada, kas tegemist on unikaalse valgustruktuuriga või on valgu evolutsiooniga kaasnenud selle substraatspetsiifilisuse muutumine. ATP N-glükosidaasi substraatspetsiifilisuse edasine uurimine käsnades võib viia selle ensüümi tõelise funktsiooni avastamiseni. Uuritavate ensüümide võimalikku rolli käsna arengus uurime merekäsna Chondrosia reniformis näitel (vastsete areng) ja mageveekäsnas Ephydatia fluviatilis (areng gemmulist funktsionaalseks käsnaks). Samuti töötame välja metoodika käsnakromosoomide eraldamiseks, mis võimaldab meid huvitavad geenijärjestused lokaliseerida käsnakromosoomidel.
The ultimate goal of the present project is to define the basic features of the gene structures and expression of two unusual ATP converting enzymes, 2’,5’oligoadenylate (2-5A) synthetase and ATP N-glycosidase, in the most ancient Metazoa, the sponges. To explain the large variability of the 2-5A synthetase enzymatic activity in sponges, we will identify the corresponding genes in a number of sponge species with substantially different enzymatic activities. For this purpose the corresponding cDNA and genomic libraries will be constructed. In G. cydonium we will identify the genomic structures and arrangement of the 2-5A synthetase paralogs, quantify their amounts in the genome and describe their enzymatic activities. Our results have indicated that a strong protein/RNA complex is responsible for the catalysis of 2-5A synthesis in sponges. We will now focus on the identification of the RNA-component of the enzymatic complex and its contribution to the direction of the amplitude and specificity of the 2’,5’ phosphodiester bond (we have shown that differently from its mammalian homologs, the sponge 2-5A synthetase is able to catalyze the synthesis of 3’,5’ phosphodiester bond). For the identification of the peptide structures of the enzymes discovered by us in sponges (2-5A synthetase and ATP N-glycosidase, 2’,5’-specific ribonuclease), these proteins will be purified from the crude sponge extracts. It permits us to evaluate the possible limitations of the recombinant DNA technology, it will give us the information about the enzyme isoforms and it will presumably help us to clarify the problem of the RNA-component in the 2-5A synthetase enzymatic complex. It will also give us a tool for searching for ATP N-glyosidase homologs in other sponges and other phyla. The results will explain the evolutionary aspects of this unusual enzyme: is this protein structure of unique nature or has the substrate specificity of the enzyme been changed in the course of evolution? The substrate specificity studies may lead to the discovery of the real function of this unique enzyme. The possible role of these enzymes in the course of sponge development will be studied in two models: the marine sponge Chondrosia reniformis (development of larvae) and the freshwater sponge Ephydatia fluviatilis (development from gemmules to a functional sponge). We will also develop the method for the isolation of sponge chromosomes to localize the genes of our interest on sponge chromosomes.