See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF7578
ETF7578 "Onkovalguga p53 seotud signaaliülekanderajad inimese embrüonaalsetes tüvirakkudes (1.01.2008−31.12.2011)", Toivo Maimets, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF7578
Onkovalguga p53 seotud signaaliülekanderajad inimese embrüonaalsetes tüvirakkudes
Oncoportein p53-dependent signalling pathways in human embryonic stem cells
1.01.2008
31.12.2011
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ValdkondAlamvaldkondCERCS erialaFrascati Manual’i erialaProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.3. GeneetikaB220 Geneetika, tsütogeneetika 1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2008−31.12.2008336 000,00 EEK (21 474,31 EUR)
01.01.2009−31.12.2009322 560,00 EEK (20 615,34 EUR)
01.01.2010−31.12.2010322 560,00 EEK (20 615,34 EUR)
01.01.2011−31.12.201120 614,80 EUR
83 319,79 EUR

Käesoleva projekti eesmärgiks on uurida p53-sõltuvate signaaliradade rolli inimese embrüonaalsete tüvirakkude pluripotentsuse säilitamisel ja nende diferentsiatsioonil. Projektis on seatud järgmised konkreetsed eesmärgid ja tegevused nende saavutamiseks: 1. p53 staatuse iseloomustamine erinevates tüvirakkude liinides. Me uurime mitmeid rakuliine (näiteks H1, H9, NCL-1) nii p53 mutatsioonide, taseme, lokalisatsiooni kui transaktivatsioonivõime suhtes. Samuti rakkude võimet reageerida apoptoosi ja/või rakutsülkli peatamisega DNA kahjustuse tagajärjel. Ehkki on teada, et normaalsed pluripotentsed tüvirakud sisaldavad tüüpiliselt muteerumata p53 (Oren et al 1982), on vajalik näidata, et rakuliinide püsiv kultiveerimine ei ole seda seisu muutnud ning p53 on stabiilne kümnete passazhide jooksul (võrreldes kõrge ja madala passazhiarvuga rakke). 2. Pärast „normaalse” p53 oleku näitamist eksponeerime tüvirakke erinevatele kasvutingimustele (fiider, seerum, lisafaktorid) ja uurime p53 taseme, lokalisatsiooni ja aktiivsuse muutusi. Samuti jälgime tuntud p53 transkriptsioonimärklaudade (p21, hdm2, bax jt.) taseme muutusi. 3. Inimese ja hiire tüvirakkude reaktsioon DNA kahjustustele. Kasutame erinevaid keemilisi (näiteks DNA topoisomeraas I inhibiitor kamptotetsiin) või füüsikalisi (röntgenkiirgus, UV-kiirgus) DNA-d kahjustavaid agente. Võrdleme rakutsükli muutusi hiire ja inimese rakkudes FACS meetodil. 4. p53 regulaatorite, eelkõige ATM/ATR ja ARF radade iseloomustamine tüvirakkudes. Eesmärgiks on leida erinevusi, millega saaks seletada p53 spetsiifilist inaktiivsust pluripotentses olekus tüvirakkudes. 5. Erinevate rakutsükli inhibiitorite kasutamine tüvirakkude diferentseerimiseks. Vastavalt meie eelkatsetele võiks oletada, et mistahes rakutsükli peatamine on signaaliks tüvirakkude diferentseerumisele. 6. Inimese embrüonaalse tüvirakuliini loomine, mis indutseeritavalt ekspresseerib tsükliinsõltuvate kinaaside inhibiitorit p21. Plaanis on kasutada tet-on süsteemi, mille puhul kontrollitav geen ekspresseerub vaid siis, kui söötmesse on lisatud tetratsükliini. Juhul kui rakkude diferentseerumiseks on tõepoolest piisavaks tingimuseks p21 ekspressioon (ja sellest tulenev rakutsükli peatumine), siis võimaldaks selline rakuliin lihtsalt ja käepäraselt hakata analüüsima söötme komponente, mis moodustavad ‚nishi’ erinevate diferentseeruvate rakkude jaoks ja seega võimaldavad rakkude tahtlikku suunatud diferentseerimist erinevateks organismi rakkudeks.
The main aim of the present project is to study the role of p53-dependent signaling pathways in keeping the pluripotent state of human embryonic stem cells and their differentiation. The concrete objectives and activites of the project are the following: 1. Characterisation of p53 status in different embryonic stem cell lines.We will study mutations of p53, its level, localisation and transcriptional activity in several stem cell lines (H1, H9, NCL-1). We will also detect the ability of cells to react to DNA damage by apoptosis/cell cycle stop. Although it is known that normal pluripotent stem cells usually contain wild-type p53 (Oren et al 1982), it is important to see, whether prolonged cultivation of cells has not changed this situation and p53 can be stable over tens of passages (comparing low passage number and high passage number cells). 2. After demonstration of „normal” state of p53 we will expose stem cells to different growth conditions (serum, feeder, additional factors)and study the changes in p53 level, activity and localisation. We will also study the changes of known p53 transcriptional targets (p21, hdm2, bax etc.). 3. Reaction of human and mouse embryonic stem cells to DNA damaging agents. We will use different chemicals (for example inhibitor of DNA topoisomerase Camptothecin) or physical (x-ray, UV irradiation) DNA damaging agents. We will compare cell cycle changes in human and mouse ESCs by FACS and describe the changes of p53 level and activity. 4. The caharacterisation of signalling pathways activating p53, first of all ATM/ATR and ARF pathways. The aim is to find the molecular differences, which could explain the specific inactivity of p53 in pluripotent cells. 5. Using different cell cycle inhibitors to differentiate stem cells. According to our preliminary data one might hypothesise that whatever chemical agent able stop cell cycle causes also the differentiation of stem cells. 6. Creation of human embryonic cell line, which inducibly expresses cyclin-dependent kinase inhibitor p21. We plan to use tet-on system, in which controlled gene expresses only in the presence of tetracyclin. If indeed expression of p21 (and stop of cell cycle) is enough to get differentiation effects of stem cells, the cell line inducibly expressing p21 would be an useful tool to study the components of growth media, which build up ‚niches’ for different cell types and therefore would be tools for directed differentiation of embryonic stem cells.