"Eesti Teadusfondi uurimistoetus" projekt ETF9289
ETF9289 "Ribosoomide reparatsioon (1.01.2012−31.12.2015)", Jaanus Remme, Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond, Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut.
ETF9289
Ribosoomide reparatsioon
Ribosome repair
1.01.2012
31.12.2015
Teadus- ja arendusprojekt
Eesti Teadusfondi uurimistoetus
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.01.2012−31.12.201217 400,00 EUR
01.01.2013−31.12.201317 400,00 EUR
01.01.2014−31.12.201417 400,00 EUR
01.01.2015−31.12.201517 400,00 EUR
69 600,00 EUR

Bioloogilised makromolekulid kannatavad tihti keemiliste kahjustuste all, mida põhjustavad nii keskkonategurid kui metaboliidid. Kahjustused likvideeritakse kas reparatsioonimehanismide abil või kahjustatud molekulid lagundatakse. DNA reparatsioon on eluks hädavajalik protsess kõigis organismides, kuna DNA koopia arv raku kohta on väike. RNA ja valgud on enamasti palju lühema elueaga, kuigi ka nendel on stabiilseid molekule. Vaatamata lühemale elueale on nii valkude kui RNA reparatsioon dokumenteeritud nähtused. Keerulisem on olukord makromolekulide kompleksidega, mille funktsionaalse reparatsiooni kohta on väga vähe andmeid. Meie põhilise tööhüpoteesi kohaselt parandatakse keemiliselt kahjustatud ribosoomid valkude vahetamise mehanismi abil. Selles projektis analüüsime ribosoomide parandamist nii bakterites kui pärmirakkudes kasutades proteoomika meetodeid. Märkides raku valgud stabiilsete isotoopidega saame söötmevahetuse abil määrata nii r-valkude eluea erinevatel kasvutingimustel kui r-valkude vahetuse. Oksüdatiivse stressi mõju r-valkude elueale ja r-valkude vahetusele ribosoomides aitab selgitada ribosoomide reparatsiooni füsiloogilist olulisust. Ribosoomivalkude vahetus nõuab ribosoomi struktuurseid ümberkorraldusi. Uurime kas ribosoomide assambleerimise faktorid (RNA helikaasid, riboosm-sõltuvad GTPaasid, ribosoomi küpsemisfaktorid) on olulised ka ribosoomide ümberassambleerimisel. Need katsed aitavad võrrelda ribosoomide de novo assambleerimise ja parandamisega seotud ümberassambleerimise molekulaarseid mehanisme. Lisaks nimetatutele saame samade katsetega vastata veel ühele olulisele küsimusele, kas ribosoomid on heterogeensed? Üldiselt arvatakse, et kõik ribosoomid on oma keemilise koostise poolest identsed ja funktsionaalselt ekvivalektsed. Proteoomiliste katsete tulemusena näeme kas ribosoomid on on oma valgulise koostise poolest ühesugused või on ribosoomid heterogeensed.
Biological macromolecules are often targets for chemical modifications by environmental factors and metabolic compounds. The damaged molecules are removed either by repair or degradation. DNA repair is essential for all organisms due to the low copy number and utmost importance of the information stored in its sequence. RNA and proteins have usually much shorter life span as compared to DNA although stable species exist for both types of macromolecules. In spite of that, repair of RNA and proteins have been documented. The situation with large macromolecular complexes is less well studied. The main hypothesis suggests that chemically damaged ribosomes are subjected to the ribosome repair by means of ribosomal protein exchange. Here we propose to study ribosome repair mechanisms in bacteria and in yeast by means of proteomic approach. We use stable isotope labeling method to analyze life time of ribosomal proteins under different growth conditions and the r-protein exchange. The effect of oxidative stress on the r-protein exchange reveals the physiological significance of the ribosome repair. Ribosomal protein exchange requires structural rearrangements in the ribosome structure. We will test an involvement of ribosome assembly factors (RNA helicases, ribosome dependent GTPases, and ribosome maturation factors) on the r-protein exchange in vivo. In this way we can compare the molecular mechanisms involved in ribosome assembly de novo and re-assembly during ribosome repair. We plan to analyze r-protein exchange and ribosome repair also in the yeast Saccharomyces cervisiae by using similar proteomic approach. Additional important question, which we can analyze with the same experiment is the question about the ribosome heterogeneity. It is anticipated that all ribosomes have the same chemical composition and that all ribosomes are functionally equal. The proteomic analysis can reveal whether the protein composition of the ribosomes is identical on the all ribosomes.
Projekt kujunes kokkuvõttes edukaks ja seda osaliselt tänu projekti eesmärkides tehtud olulistele muudatustele. Arvestades teaduses kujunenud konkurentsiolukorda osutus otstarbekaks pöörata enam tähelepanu EF-P ja teda modifitseerivate ensüümide osalemisele valgu biosünteesil. Tegime kindlaks EF-P unikaalse modifikatsiooni keemilise struktuuri (Peil et al 2012) ja senitundmata ensüümi YfcM, mis EF-P Lys34 hüdroksüleerib. Järgnevate katsete käigus selgitasime välja, milliste mRNA järjestusemotiivide sujuvaks translatsiooniks on vajalikud EF-P ja mil määral EF-P modifikatsiooniensüümid EpmA (YjeA), EpmB (YjeK) ja EpmC (YfcM). Selgitasime välja, et lisaks varem leitud oligo-proliinile on nii EF-P kui EpmA ja EpmB vajalikud veel kindlate järjestusemotiivide translatsiooniks. Nende puudumisel tekivad valgusünteesi elongatsiooni pausid, mis viivad translatsiooni protsessiivsuse vähenemisele (Peil et al 2013). Laindasime oma uuristöö teemat vastavlt taotluses kavandatule pärmi ribosoomivalkude uurimisele. Esimse etapina sel suunal töötasime välja pärmi ribosoomivalkude kvantitatiivse analüüsi meetodi mass-spektromeetria abil kasutades SILAC märkimist. Meetodit kasutasime edukalt r-valkude seondumise stabiilsuse uurimiseks rRNAga. Saadud tulemused näitavad, et pärmi r-valgud on märgatavalt kergemini dissotseeritavad ribosoomidelt kui bakteri r-valgud. Seega on pärmides r-valgud kergemini asendatavad ja ribosoomide parandaqmine valkude vahetuse teel on pärmi ribosoomides kergem kui bakteris (Piir et al 2014). Aruandlusealuse projekti raames uurisime pärmi ribosoomi subühikutevahelise silla eB12 põhikomponendi, valgu eL19 eri domeenide rolli ribosoomide biogeneesil ja ribosoomid talitluses. Tulemused avaldatud (Kisly et al 2016). Bakteri ribosoomide parandamisega seotud eksperimentaalne töö on põhiliselt avaldamata, aga see on aluseks Kaspar Reieri magistritööle, mis tuleb kaitsmisele 2016. a.